エアロゾル粒子のpH条件下におけるA型インフルエンザウイルスの不活性化メカニズムの全ウイルスHDX-MSによる解析

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2023年8月18日
エアロゾル粒子のpH条件下におけるA型インフルエンザウイルスの不活性化メカニズムの全ウイルスHDX-MSによる解析

https://journals.asm.org/doi/10.1128/msphere.00226-23?utm_source=twitter&utm_medium=social&utm_content=ASM&utm_id=falcon&utm_campaign=mSphere


著者 Shannon C. David https://orcid.org/0000-0003-3345-9443, Oscar Vadas, Irina Glas, Aline Schaub, Beiping Luo, Giovanni D'angelo, Jonathan Paz Montoya, SHOW ALL (18 AUTHORS), Tamar Kohn https://orcid.org/0000-0003-0395-6561 tamar.kohn@epfl.chAUTHORS INFO & AFFILIATIONS
DOI: https://doi.org/10.1128/msphere.00226-23
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要旨
A型インフルエンザウイルス（IAV）を含む複数の呼吸器ウイルスは、呼気エアロゾル粒子を介して感染する可能性があり、最近、エアロゾルのpHが空気中のウイルス感染性に影響を及ぼす主要な因子であることが明らかになった。IAVは、宿主のエンドソーム内で遭遇する弱酸性の条件に対して感受性が高いことが知られているが、より酸性度の高いエアロゾルの微小環境においても、同じメカニズムによってウイルスが不活化されるかどうかは不明である。ここで我々は、一過性のpH4への暴露が、主にウイルスタンパク質ヘマグルチニン(HA)の融合後コンフォメーションが早期に達成されることに起因する、感染力価の最初の急激な低下という2段階のプロセスによって、IAVの不活化を引き起こすことを同定した。タンパク質の変化は水素-重水素交換質量分析（HDX-MS）により、酸性条件への暴露後10秒から観察された。われわれのHDX-MSのデータは、X線結晶構造解析のような、より労力のかかる他の構造解析技術と一致しており、IAVのようなエンベロープウイルスにおいても、全ウイルスHDX-MSによるタンパク質の多重解析が容易で有用であることを強調している。さらに、ビリオンの完全性は酸性条件下で部分的ではあるが不可逆的な影響を受け、内部マトリックスタンパク質1（M1）のアンフォールディングが進行し、時間の経過とともにウイルスの感染性がより緩やかに低下した。一方、ゲノムや脂質エンベロープには酸による変化は見られなかった。呼気エアロゾル内における呼吸器ウイルスの運命に関する理解を深めることは、世界的な公衆衛生上の優先事項であり、ここで得られた情報は、将来、季節性インフルエンザおよび／またはパンデミックインフルエンザの空気中における持続性を制御するための新たな戦略の開発に役立つ可能性がある。
重要性
COVID-19、インフルエンザ、その他多くの呼吸器疾患は、エアロゾル化したウイルスの吸入によって感染することがよく知られている。多くの研究により、これらの空気感染ウイルスの生存時間には限りがあることが示されているが、何がウイルスの感染力を低下させるのかについては未解決のままである。ここでは、A型インフルエンザウイルスについて、呼吸器エアロゾル粒子に関連した条件下でウイルスに生じる構造タンパク質の変化を調べることにより、この疑問に取り組む。これまでの研究から、排出されたエアロゾルは室内の空気と平衡化することで強酸性になることがわかっており、我々の結果は、2つのウイルスタンパク質がこのような酸性条件によって複数の部位で影響を受け、ウイルスの不活性化につながることを示している。この結果は、エアロゾルの酸性化速度を速める空気処理法を開発することが、空気中の感染性バイオブルデンを制御する主要な戦略になることを示唆している。
はじめに
感染性病原体の空気感染は、病原体が宿主間を移動する間にエアロゾル輸送を生き延びる能力に依存している。SARS-CoV-2(1～7)、ヒトライノウイルス(8～11)、呼吸器合胞体ウイルス(12)、ヒトアデノウイルス(13)、A型インフルエンザウイルス(IAV)(14～23)など、多くの呼吸器系ウイルスにとって、呼気エアロゾルが主要な感染経路であることを示す文献的証拠が増えている。特定の環境条件下、特に換気の悪い室内環境では、エアロゾル経路が支配的である。ある研究では、家庭内でのIAV感染の半分は空気感染によるものと推定されています(19)。しかし、呼気エアロゾル内でウイルスが不活化されるメカニズムについては、依然として根本的な理解が不足しています。
呼気の際、エアロゾルは急速に水分と熱を失い、室内環境との平衡が確立されるにつれて体積が大きく変化する。温度、塩分濃度、相対湿度、呼吸器系界面活性剤の存在、気液界面相互作用がすべて関与していると考えられている(24 - 27)。重要なのは、エアロゾルのpHが、エアロゾル内でのウイルスの運命を決定する主要因であることが最近認識されたことである（28、29）。典型的な室内空気に吐き出されると、吐き出されたエアロゾル粒子のpHは中性から急速に逸脱し、～4まで低下する（29、30）。このような低いpHは、酸に弱いウイルスの不活化を引き起こす可能性がある。特にIAVはエンドソーム内で遭遇する酸性条件（37℃、pH〜5.5）に敏感で、pHによって誘導されるHAへの構造変化がこの感受性の原動力となっている(31, 32)。pHで活性化された形のHA-融合後コンフォメーションとも呼ばれる-は、HAがエンドソームとウイルスエンベロープ間の膜融合を仲介し、ウイルスのアンコーティングと侵入を可能にする。しかしながら、もし融合後コンフォメーションが早期に達成されると、HAは宿主細胞と結合できなくなり、ウイルスは効果的に不活化される。同じメカニズムが、呼気エアロゾル中のより酸性条件下でIAVの不活化を促進するかどうかはまだ確認されていない。エアロゾルのpHは、酸によって誘導される一般的なタンパク質の折りたたみ解除の範囲内であり［塩基によって誘導されるタンパク質の折りたたみ解除は通常pH10以上を必要とするのに対して、pH2から5の間で起こる(33)］、エアロゾル内でのIAVの不活化が、全体的なタンパク質の変性によるものなのか、それともHAに特異的なものなのかは、まだ解明されていない。
本研究では、エアロゾル中のpHがIAVの構造的完全性に及ぼす影響を調べ、その結果生じるウイルス感染サイクルへの影響を明らかにした。蒸発するエアロゾルの微小環境内に存在する他の要因からpHの影響を切り離すため、室内空気中のエアロゾル粒子を代表するpH値に制御されたバルク溶液でこの研究を実施した。また、IAVは11個のタンパク質からなる複雑なビリオンであり、その一部は膜に包埋されているため、構造解析には一定の課題があります。酸性エアロゾル条件下でIAVのタンパク質に生じる可能性のある変化に関する高分解能の情報を得るため、私たちは水素重水素交換質量分析法（HDX-MS）を利用しました。この方法は、タンパク質の局所的および全体的なコンフォメーション変化を、ネイティブに近い環境で評価するものです。重水素化緩衝液（D2O）中で目的のタンパク質をインキュベートすると、アミド水素は受動的に重水素と交換し、その交換速度は個々のアミドの構造環境に依存する(34)。そのため、タンパク質を異なる条件に曝した後、同等のペプチドのアミド交換速度を比較することで、タンパク質の局所構造の変化を区別することができる(35)。重要なことは、重水素は無傷のウイルスキャプシド中を通常の水と同じように拡散するため、この手法によって全ウイルスコンフォメーションのタンパク質を調べることができるということである(36 - 41)。
IAV全体にHDX-MSを適用した先行研究は2件あるが、どちらも表面に露出したHAタンパク質に対する宿主エンドソームのpH（〜5.5）の影響に焦点を当てたものであった(42, 43)。われわれはHDX-MS分析の多重化を図り、3つの異なるウイルスタンパク質、すなわち表面に露出したHA、中層マトリックスタンパク質1（M1）、内部核タンパク質（NP）を同時に分析した。内部IAVタンパク質は、ネイティブまたは酸性条件下で、これまでHDX-MSを用いて特性評価されたことはなかった。タンパク質構造の研究を補完し、IAVの状態をグローバルに解析するため、ウイルスゲノムとウイルス脂質の完全性も評価した。
結果
IAVは呼気エアロゾル条件下で急速に不活化される
ヒトの呼気エアロゾルの大部分は5 µm未満であり、呼吸活動の大部分は1 µm未満である(8, 44)。これまでの研究では、感染者のこれらのサイズのエアロゾル中にインフルエンザウイルスが特異的に同定されている(23, 45, 46)。呼気時、エアロゾルは急速に水分を失い、硝酸やアンモニアなど、室内空気に存在する酸性および塩基性の微量ガスと平衡化する。我々は以前、初期半径1μmの呼気粒子が、この平衡化によってpH～4まで酸性化することを示すために使用した生物物理学的呼吸エアロゾルモデル（ResAM）を発表した（29）。粒子の初期サイズによって、pHの変化は異なる。ここでは、ResAMを用いて、ヒトが生成する「微細」エアロゾルの範囲を代表する3つの異なる初期サイズ（半径0.2 µm、1 µm、5 µm）の呼気粒子のpH軌跡を推定した。ResAMは、3つの粒子径すべてで同じ終末酸性pH～4に達すると予測し、モデル化した最小粒子径では呼気後10秒未満でこのポイントに達した（図1A）。粒子が大きいと、微量酸の粒子内への拡散により多くの時間が必要となるため、酸性化プロセスは遅くなると予測されたが、すべてのケースで終末pH～4に到達した。
図1

図1 呼気エアロゾルの酸性化とIAV感染性への影響。(A)呼気エアロゾル粒子が鼻腔内微小環境から典型的な室内空気に移行する際の平均pH。粒子は時間とともに蒸発し（秒単位）、pH〜3.8まで酸性化する。pHの漸進的変化は、3つの異なる初期サイズの粒子についてモデル化されている。縦のエラーバーは、各時点でのエアロゾル殻の最内側と最外側の間のpH範囲を示し、平均pHは連続線として示されている。熱力学的および動力学的特性は、代表的な呼吸器マトリックスである合成肺液（SLF）のものである。室内空気条件は20℃、50％RHとし、呼気は50cm2/sの乱流渦拡散係数を用いて室内空気に混合すると仮定した。(B) 酸性pH 4への曝露によるIAVの不活化。IAVをPBSまたはpH 7緩衝液の中性溶液にスパイクするか、酸性pH 4緩衝液にスパイクした。スパイク後の複数の時点（最大86,400秒または24時間）でアリコートを採取し、プラークアッセイで残存ウイルス量を定量するために中和した。pH 4サンプルでは、ウイルス濃度がウイルス崩壊速度に影響しないことを示すため、106 PFU/mLまたは107 PFU/mL（10×IAV） でウイルスをスパイクした。データポイントは、各時点での3連測定の平均値±SDを示し、初期濃度（C0 ）に対する各時点での残存濃度（C）のlog10として表示した。データは3回の独立した実験から集計したもので、Cが各プラークアッセイの検出限界以下であったデータポイントは開記号で示した。点線は減衰がないことを示す。(C) pH 4 または 7 で 10 秒間または 30 秒間処理した IAV サンプルで感染させた A549 細胞の免疫蛍光画像。A549細胞を感染多重度（MOI）2で感染させ、感染後3時間の核タンパク質の免疫蛍光染色によってIAVタンパク質の産生を可視化した。スケールバーは75 µm。画像は二重実験の代表である。(D）レニラ・ルシフェラーゼをコードするVSV粒子を、野生型表面タンパク質Gを発現するVSV（VSV-G）と比較するために、A/WSN/33ウイルス（VSV-H1N1）のHAとNAで偽タイプ化した。いずれのVSV株もpH 4まで酸性化し、10秒または30秒のpH曝露後にサンプルを中和した。各VSV株のコントロールサンプルはpH 7に保った。その後、MDCK細胞で感染後7時間のルシフェラーゼ活性を測定することにより、処理したVSVサンプルの侵入能力を決定した。データは3回の独立した実験から得られたもので、サンプルは二重に定量した。データは、非処理サンプルのRLU（RLU0）に対する各時点での相対光単位（RLU）のlog10として示した。点線は減衰がないことを示す。(E）IAV粒子をCと同様にpH処理し中和した後、融合後のHAコンフォメーション（紫色）を認識するHA特異的抗体で染色した。NP特異的抗体（青）での染色は、サンプル間で同量のウイルス物質が沈着していることを確認するためのコントロールとした。スケールバーは250μmに対応する。画像は二重実験の代表である。
まず、室内空気と平衡化したエアロゾルの代表的な条件下（室温、pH 4）で、IAVの不活性化の動態を調べた。感染性データ（図1B）によると、室温でpH 4に一過的に暴露した場合、ウイルスは急速に不活化され、感染性ウイルス力価はpH 4に暴露後10秒以内に約3-log10、30秒後には5-log10以上減少した。一方、pH 7溶液またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（いずれも中性対照）にIAVをスパイクし、同じ温度に保持した場合、24時間のモニタリング期間中、ウイルス力価の減少はほとんど見られなかった。また、pH 4に暴露したウイルスサンプルは、中性対照と比較して、感染後3時間（図1C）または6時間（図S1）の時点で宿主上皮細胞に生産的な感染を示さなかったことから、低pH処理によってウイルス感染サイクルの初期段階が特に損なわれたことが示唆された。
このウイルス崩壊が（一般的なタンパク質のアンフォールディングではなく）HAによって特異的に媒介されうるかどうかを調べるため、偽タイプの水疱性口内炎ウイルス(VSV)株を用いた。VSVはH1N1 IAV表面タンパク質HAとノイラミニダーゼ(NA)で偽タイプ化され、VSV-H1N1となった。pH4における偽型VSV株の不活化動態は、野生型IAVの不活化動態と非常によく似ており、10秒のpH曝露後に感染力が〜3-log10減少し、残存感染力は30秒後には検出限界以下となった（図1D）。IAVのNAは宿主細胞内でのウイルスの付着や脱コーティングには機能しないので、この結果は偽型VSVのウイルス不活化の大部分がHAへの非可逆的変化によって媒介されていることを示している。コントロールVSVは、宿主細胞付着のためにHAではなく野生型Gタンパク質を発現しているが、同じpH処理の結果、感染性の損失は見られなかった。重要なことは、VSVのGタンパク質は宿主細胞とのエンベロープ融合を媒介するために、IAV HAと同様の低pH構造変化を起こすが、Gタンパク質への変化は完全に可逆的であるということである(47)。さらに、pH処理したIAV粒子全体の蛍光イメージングでは、pH 4に10秒間暴露した後、HAの融合後型に対する染色性が増加した（Fig. pH 7ではいくらかの低レベルシグナルが観察されたが、これはバックグラウンド染色によるものであった。
一過性の酸性への暴露は、外部IAVタンパク質ヘマグルチニン(HA)に局所的な構造変化を引き起こす
Fig. 1のデータから、pH 4の条件下でIAVの感染性が失われたのは、一般的なタンパク質の変性ではなく、HAが融合後の形にコンフォメーション変化したためであることが示唆された。このことを確認し、pH 4の影響を受けたHAの特定領域をマッピングするため、全ウイルスHDX-MSを利用した。不活性IAV粒子は中和の前にバルク溶液中で急速にpH 4に酸性化され、一方コントロールは同じ暴露時間、中性に保たれた。その後、H/D交換反応をクエンチして交換した重水素を固定する前に、すべてのサンプルをD2Oバッファーの中で氷上で一定時間インキュベートしました。クエンチの間、全ウイルスも尿素とギ酸の混合液で溶解し、その後のプロテアーゼ消化とHDX-MS分析のために内部タンパク質を放出させた。pH処理、中和、D2Oインキュベーションの間、ウイルスをほぼネイティブなコンフォメーションに保持するために、最終段階としてウイルス溶解が組み込まれた（図2AのHDX-MS概略図）。
図2

Fig 2 一過性の酸性条件下への暴露後の全IAVからのHAタンパク質のHDX-MSによる特性解析。(A) 全ウイルスHDX-MSプロセスの概略図。中和された全ウイルスサンプルは、ペプシン消化とLC-MS分析の前に、D2O緩衝液中で30、300、または3,600秒間インキュベートされ、その後クエンチされる。外側のヘマグルチニン、内部のマトリックス1（M1）および核タンパク質は、見やすくするために青色に着色した。(B)中性条件（pH 7）で30秒間保持した全IAVサンプルのHAタンパク質の水素/重水素（H/D）交換率を測定した。データポイントは、3連サンプルのH/D交換の平均パーセンテージ±SDを示す。ペプチドはHAの公表されている配列（Uniprot: P03452）に沿って、個々のペプチドの中心アミノ酸の位置に従って直線的に整理した。連続線はMSで連続的にペプチドをカバーする領域を示す。二峰性の活性を示すペプチドはグラフから除いた。目的のタンパク質ドメインはグレーの網掛けと白線で示す： FPは融合ペプチド、TMは膜貫通ドメイン、Cytは細胞質領域。(C) pH 7のコントロールサンプルと比較した、pH 4に10秒または30秒暴露することによって誘導されるH/D交換パーセントの差を示す残差プロット。個々のデータ点は、3連サンプルのH/D交換の差の平均パーセンテージを示す。点線はH/D交換に差がないことを示す。H/D交換の増加を示す目的のペプチドには1-6の番号を付けた。(D)pH4暴露後にH/D交換の増加を示す選択したペプチド1-6の取り込みプロット。データは、30秒、300秒、または3,600秒のD2Oインキュベーション後のpH 7または4のサンプルのH/D交換の総パーセンテージを示す。データポイントは、3連サンプルのH/D交換の平均パーセンテージ±SDを示す。データは二元配置分散分析（**P < 0.01、***P < 0.001、***P < 0.0001、各D2O時点の30秒pH曝露サンプルを比較した場合。10秒pH曝露サンプルの比較の統計結果は表S1に示す）。(E)A/PR8HAの結晶構造（PDB: 1RU7）にマッピングした、pH4（対照pH7と比較して）30秒後のH/D交換率の増加（赤）または減少（青）、あるいはH/D交換率の変化なし（灰色）を示すタンパク質領域。白はペプチドをカバーしていない領域を示し、二峰性の活性を持つペプチドは黒で着色されている。パネルDのペプチド6（521-532）は、結晶構造がこれらの残基の前で切断されているので示されていない。
HAタンパク質自身は、膜に包埋された領域と、タンパク質をウイルスマトリックス層に固定する内部領域とで、IAV全体の表面にホモ3量体として存在している(Fig. 2A)。各HA単量体は2つのサブユニット、HA1とHA2からなり、短く比較的柔軟なヒンジ領域でつながっている。この表面に露出した糖タンパク質のグローバルなD2O取り込みレベルを特徴づけるために、まず中性pH 7条件のIAVが用いられた。HAは速く変化する領域と遅く変化する領域が交互に現れ、動的でより構造化された領域の存在を示唆した(Fig. 2B)。ペプチドカバレッジはHA1領域では高く、膜に結合したHA2領域ではかなり減少していた。HA2の被覆率の低下は、別のIAV株のHAを分析した以前のHDX-MS研究でも観察された(42, 43)。全体として、IAVのHA1内の残基の74%とHA2内の残基の30%が、我々の全ウイルスHDX-MS分析でカバーされた(Fig. S2)。我々の研究で分析されたペプチドは、HDX-MSによるHAの先行研究(42)と重水素化レベルにおいて良い相関を示し、異なるウイルス亜型と株（H3N2 X-31 vs H1N1 A/WSN/33）を用いたにもかかわらず、高交換領域と低交換領域が同じであった。
中性pHでのHAダイナミクスの特徴付けに続いて、ウイルス全体を一過的にpH4で処理した後のH/D交換率を特徴付けた。ここでは3つの異なるD2Oインキュベーション時間（30秒、300秒、3,600秒）を用い、高度に柔軟な領域だけでなく、より構造化された領域で起こるpHによる変化を検出できるようにした。Fig.2Cは中性とpH 4の条件下でのH/D交換率の比較を示し、酸処理後に交換が増加したいくつかの興味深いペプチドが同定された（検出されたすべてのHAペプチドの交換レベルについてはTable S3を参照）。交換が増加したこれらのペプチドは、低pHではわずか10秒後に検出され、pH暴露時間を30秒に増やしてもこれらの差は増幅されなかったようである。HDX-MSの前に全サンプルを中和することで、これらのpHによる変化が非可逆的であることが確認されたので、新しい宿主の粘膜上で酸性化したエアロゾルを再吸入し中和した後の、IAV全体のHAタンパク質の状態を示していると思われる。
6つの個別ペプチドがpHの結果として有意差を示し、そのうちの5つはHA1鎖内に局在していた（Fig.） 最初に同定されたペプチドは残基51-58のものであった(Fig. 2D のペプチド1)。30秒のD2Oインキュベーション後のこのペプチドのH/D交換率は、pH条件（pH 4 vs 7）間で同等であったが、300秒と3,600秒の長いD2O暴露後には有意差が現れた（すべての統計的比較については表S1を参照）。ペプチド1はHA1サブユニットの融合ドメイン(F')内に位置する。pH4処理後にここでH/D交換が上昇したのは、タンパク質が融合後のコンフォメーションに移行する際に、このドメインと近接した位置にあるHA2サブユニット［(48)で報告されている］の間の安定化接触が破壊されたためと思われる。ペプチド5(残基317-328)は同じ融合領域にあり、pH 4処理後H/D交換が同様に促進された。H/D交換率がHAタンパク質の特定の部分でのみ変化していることを強調するため、pHの影響を受けなかった2つのペプチドもFig.
ペプチド2（残基81-92）と3（残基89-95）は重なっているが、検出されたH/D交換の速度論に差があり、80-90領域が90-95領域より動的であることを示唆している。HAの高分解能X線結晶構造[PDB: 1RU7 from (49)]は、80-90領域にαヘリックスがあることを示唆しており、構造化されていない90-95領域（Fig. 2Eでハイライトした位置）よりもH/D交換から守られていると予想されたため、これらの観察は予想外であった。ペプチド4(残基113-117)はHA1のvestigialエステラーゼ(E′)サブドメインにあり、α-ヘリカル領域とループにまたがっている。このペプチドのH/D交換率は、どのD2Oインキュベーション時間でも非常に有意な増加が観察され、pH 4処理により二次構造要素が急速に展開する可能性を示唆している。ペプチド4はまた、融合前のコンフォメーションではHAホモ三量体の中心に埋もれ、中性条件下ではHA2サブユニットのβループと密接に接触している。融合後の確認では、HA1のRBDは中心ストークから離れるように回転し(43, 50)、HA2との接触が解除され、以前は保護されていたこれらのペプチドはより外部環境にさらされた状態になる。
ペプチド6(残基521-532)はHA2のアンカー膜貫通領域の直前に位置する。ポスト融合HAへの移行中、この膜の近位領域は無秩序になると報告されており(50)、ここでpH 4に暴露した後に観察されたH/D交換速度の大きな増加と一致する。H3N2型IAV株X-31のHAのC末端領域におけるH/D交換の同様の増加が、融合後にGarciaらによって観察された(42)。興味深いことに、EX1動態とも呼ばれる二峰性分布を示すHA内の1つのペプチド（残基402-418、Fig.
ペプチドの二峰性分布はHAタンパク質のβループの酸性暴露によって誘導される
二峰性のH/D交換挙動を示す1つのペプチド(HA2, 402-418)が、pH 7とpH 4処理後に検出され、これは異なるコンフォメーションを持つ別個の集団の存在を示唆している。このペプチドはHA2サブユニットのβループ内に位置し（Fig. 3A）、pHトリガーHAにおいてそのコンフォメーションを変化させ、柔軟なループから安定化したαへリックスへと変化することが知られている主要な領域の一つである。中性条件下では、このペプチドに対して最初に単峰性のH/D交換が検出された。代表的なスペクトル(Fig. 3B)は、30秒のD2Oインキュベーション後の402-418ペプチドの質量シフトと各集団の割合を示し、pH 7サンプルでは単一峰の分布を示している。その後、D2Oインキュベーション時間が長くなると、第二の集団（オレンジ色）が区別できるようになり、二峰性分布を示すようになったが、これら2つのピークはD2Oインキュベーション期間全体（1時間まで）でほとんど重なっていた。逆に、この二峰性分布は、全ウイルスのpH 4処理後の短いD2Oインキュベーション時間でも観察された。また、2番目のピークはコントロールサンプルよりも大幅に重水素化されていた。デコンボリューション解析を適用して各集団の割合を定量したところ、pH 4の条件下で暴露した後、この2番目の重水素化度の高い集団が優勢であることが示された（図3C）。
図3

Fig 3 全ウイルスHDX-MSによって同定されたIAV HA内の二峰性H/D交換領域。(A) HDX-MS分析により、HAペプチド402-418（HA2サブユニットの一部）が二峰性活性を示すことが明らかになり、このペプチドはA/PR8 HA (PDB: 1RU7)の結晶構造上でオレンジ色にハイライトされている。(B)pH7群とpH4群の3連サンプルの代表的スペクトルは、D2Oインキュベーション時間の増加とともに二峰性ペプチド402-418の質量シフトを示している。質量シフトは非重水素化バッファー（ND）でインキュベートしたサンプルと比較している。二峰性エンベロープは灰色とオレンジ色で分けられている。(C) 左（グレー）と右（オレンジ）の集団の割合を時間と共にグラフ化。データはHDX-MSで分析した3連サンプルの平均±SDを示す。
二峰性の交換挙動は、2つの異なるコンフォメーションが存在することを示しており、1つの状態から別の状態への移行時に長距離のアロステリックな再配列が起こる。Benhaimら(43)は、H3N2株X-31のHA β-ループについて、37℃の宿主温度でpH 5で酸性化した後、同様の観察を報告した。彼らの研究では、pH暴露の〜1分後に中間的で高度に重水素化されたピークが出現し、pH暴露が進むにつれて徐々に消失し、高度に保護されたセグメントに取って代わられた。われわれの条件では、暴露時間が短すぎてこのような2番目のピークの漸進的消失が見られないことから、HAはコンフォメーション変化のごく初期段階にあることがわかる。
低pHへの一過性の暴露はビリオンの完全性にわずかな影響を与えるが、ゲノムの完全性や脂質含量には影響を与えない
表面に露出したHA3量体タンパク質のコンフォメーション変化をモニターすることに加え、全IAVをpH曝露した時にウイルス粒子とゲノム物質の構造的完全性が影響を受けたかどうかを調べた。HDX-MSで観察されたHAの構造変化は、10秒または30秒のpH4曝露で非常によく似ていたが、感染力価は低下し続けたことから、不活性化の新たなメカニズムが起きていることが疑われた（Fig.）
最初に、pH処理後のウイルスカプシドの構造をTEMイメージングで評価したところ、中性条件下（PBSとpH 7）のIAVは球形／卵形で、ビリオンはグリッド上に比較的よく分散していた（Fig.） HAのスパイクも容易に見ることができ、ウイルス表面全体によく組織化されていた。対照的に、ウイルスをpH 4にさらすと（30秒）、ビリオンは凝集し、単一粒子または小さなクラスターとして現れたものは構造的完全性が低下していた。最も顕著なことは、pH処理後、個々のビリオン表面のHAスパイクの組織化が損なわれたことで、HAが一過性の酸性にさらされた後、不可逆的なコンフォメーション変化を起こしたという新たな証拠が得られた。融合後のHA3量体複合体は、融合前には埋もれていたHA2ステム内の疎水性領域を露出させることが知られている(51 - 53)。HAのコンフォメーション変化によるビリオンの疎水性の増加は、pH 4で観察されたウイルス粒子の部分的凝集を媒介すると思われる。我々の以前の研究で、我々の系ではウイルスの凝集が感染力価低下の原動力ではないことが立証されていることに注意することが重要である(29)。一部のビリオンはTEMでも溶解過程にあるように見えたが、全体的にはpH 4処理後、ほとんどのウイルス粒子は構造的に無傷のように見えた。
図4

図4 IAVの構造的完全性に対するエアロゾルpHの影響。IAVをpH 4に調整し、30秒後にpH 7に中和し、対照サンプルは同じ時間pH 7に模擬調整するか、PBSのみに懸濁した。(A）中和したサンプルとコントロールのサンプルをPFAで固定し、2％酢酸ウラニルで染色した後、Tecnai Spirit TEMを用いて画像化した（30,000×および120,000×の倍率で画像化）。画像は複製サンプルの代表例である。(B)RNA抽出およびRT-qPCRによるゲノム定量を行う前に、中和ウイルスサンプルをRNaseまたはPBS存在下でインキュベートした（RNaseコントロールなし）。データは3連サンプルの平均ゲノムコピー/mL±SDで示した。データは二元配置分散分析により解析した（***P < 0.01, ***P < 0.001, ns, not significant）。
さらに、pH処理中にRNAの放出が起こるかどうかを調べることによって、ウイルスの完全性を調査した。全ウイルスサンプルをpH 4またはpH 7に30秒間暴露し、その後pH 7に中和した。サンプルを2つのグループに分け、一方をRNaseで処理し、もう一方をPBS（RNaseなし）と混合した後、全サンプルを37℃で30分間インキュベートした。その後、サンプルはウイルスRNA抽出とRT-qPCRによる定量に供された。RNアーゼ処理をしていないサンプルは、pHの前処理に関わらず同等のゲノム増幅を示し（図4B）、ここで増幅されたIAVゲノムのセグメントはpHだけでは影響を受けないことが示された。さらに、ウイルス全体を30分まで酸性pHに曝露しても、増幅されたゲノムセグメントに変化は見られなかった（図S3）。しかし、RNアーゼと混合したサンプルでは、増幅可能なRNAコピーのレベルは様々であった。PBSとpH 7の対照サンプルでは、RNase処理後も増幅RNAのコピー数は有意に低下しなかった。これは、増幅されたゲノムセグメントが、無傷のビリオン全体による分解から十分に保護されていることを示している。逆に、pH 4で処理したサンプルでは、RNase処理後に増幅可能なゲノムが著しく減少した。全体として、30秒後のpH 4処理サンプルの総ゲノムコピーの減少は約2-log10であった。有意ではあるが、これは感染性で観察された力価の減少（同じ時間枠で5-log10以上のウイルス力価の減少）と同じ大きさではなく、ウイルスの完全性の喪失が不活化に寄与している可能性が高いが、主な要因ではないことを示している。
最後に、pH処理がIAV脂質エンベロープ内の脂質クラスに影響を与えるかどうかを評価した。ここでは、液体クロマトグラフィー/質量分析（LC/MS）アンターゲットリピドミクスを用いて、全ウイルスをpH 4、5、7に30秒間暴露した後、500種の脂質の相対量を測定した。主要なウイルス脂質（例えば、ステロール）についてはここでは考慮しておらず、今後の研究で脂質の変化の可能性をより詳細に評価する予定であるが、データから、酸性pH曝露後の脂質エンベロープ組成には、目的の時間スケールにわたって大きな変化はないことが示された。
常温での酸性暴露は内部の核タンパク質（NP）には影響しない
pH処理の結果、破裂するビリオンがあることから、内部タンパク質NPのコンフォメーションにも影響があるかどうかを調べることが興味深かった。ここで全ウイルスHDX-MSのマルチプレックス機能が役に立ち、HA分析に使われたのと同じサンプルセットを今度はNPの構造変化について分析した。中性条件(pH 7)では、NPは特にタンパク質のC末端に向かって、多くの本質的に柔軟な領域を示した(Fig. 5A)。pH7とpH4で処理したサンプルを比較すると、NP内のどのペプチドでもH/D交換率に有意な変化は検出されず（図5BとC；NPペプチドの全リストは表S4）、部分的なウイルス溶解と酸性条件下への暴露にもかかわらず、コンフォメーション変化や局所的なアンフォールディングが起こっていないことが示された。NPはこの研究で最も高いペプチドカバレッジを示し、全配列の75％が少なくとも一つのペプチドでカバーされていた（図S5）。カバーされていない領域がpHに誘導されたコンフォメーション変化を示す可能性は否定できない。
図5

図5 一過性の酸性条件曝露後の全IAV由来NPタンパク質のHDX-MSによる特性解析。(A）中性条件（pH 7）で30秒間保持した全IAVサンプルのNPタンパク質について、H/D交換率を測定した。データポイントは、各ペプチドの中心アミノ酸を用いてプロットしたH/D交換の平均パーセンテージ±SDを示す（n = 3, Uniprot: P03466）。連続線はMSによる連続ペプチドカバレッジ領域を示す。nNLSは非従来型核局在シグナル、RBLはRNA結合ループ、cNLSは従来型核局在シグナル、NASは核蓄積シグナル、TLはテールループ。(B)全ウイルスサンプルは、HDX-MSで処理する前に、中性pHに保持するかpH4に調整し、10秒または30秒後にpH7に中和した。データは、対応するpH 7のコントロールサンプルと比較した場合の、pH 4への暴露によって誘導されたH/D交換パーセントの差を示す残差プロットとして示される。個々のデータポイントは、3連サンプルのH/D交換の差の平均パーセンテージを示す。(C) A/WSN/33 NP (PDB: 2IQH)の結晶構造、HDX-MSでカバーされた領域を示す。白はHDX-MSでペプチドがカバーされていない領域を示す。NPのヘッドドメインとボディドメイン、RNA結合ループとテールループは、Yeら(54)に基づいて注釈されている。
内部タンパク質マトリックス1(M1)のC末端の柔軟性は、常温の酸性にさらされることで誘導される。
最後に、主要なカプシドタンパク質であるM1がpH処理したサンプルで構造的に変化しているかどうかを調べた。M1は2つの主要ドメイン、すなわち球状のN末端ドメイン（NTD）と比較的に構造化されていないC末端ドメイン（CTD）を持つα-ヘリカルタンパク質であり、これらはコイル状のリンカー配列によって連結されている(55, 56)。M1タンパク質はウイルスエンベロープの下に「殻」層を形成しており、ウイルス侵入時にM1が低pHにさらされると、M1層が解離し、最終的にウイルスが分解して宿主細胞の細胞質にゲノムが放出されると考えられている(57 - 59)。しかしながら、この現象に伴うM1の構造変化は、HAのそれと比べてあまりよく分かっていない。
中性条件下(pH 7)でのM1のHDX-MS分析は、50%以上のh/D交換を示す複数のペプチドによって示される、非常に動的なCTDを明らかにした(Fig. 6A)。M1のC末端の柔軟性は、M1に関する現在の文献と一致しており、標準的ではるかに手間のかかる結晶学的手法ではこの領域の分離に問題があることが報告されている(60)。HAと同様に、M1タンパク質のN末端領域は膜と密接に結合しているため、HDX-MSで膜結合ドメインから生成されるペプチドがかなり少なく、カバレッジの制限が生じた。にもかかわらず、全体のM1タンパク質配列の68%は少なくとも一つのユニークペプチドでカバーされた（Fig.） pH 4で処理したサンプルをこの中性状態と比較すると、M1 NTDで検出されたペプチドのH/D交換率は、1つの例外を除いてpH処理による影響を受けなかった（図6B）。残基128-141を包含するループは、驚くべきことに、pH 4に曝すとH/D交換から保護された（図6CとDのペプチド1）。このことは、同じ領域をカバーする2つのペプチドが重なっている場合にも示され（図6C）、この観察は、この領域がpH 4にさらされると、より構造化されたコンフォメーションをとることを示唆している。これと一致するように、中性と酸性条件下でのM1のX線結晶構造を比較した先行研究では、135残基を中心とするループを除けば、NTD内の構造差はごくわずかであることが示された(55)。このことからも、HDX-MSによる構造解析は、一般的な方法よりもはるかに労力がかからず、しかもウイルスを本来のコンフォメーションで保持できるという利点があることがわかる。
図6

図6 一過性の酸性条件曝露後の全IAVからのM1タンパク質のHDX-MSによる特性解析。(各ポイントは、中心アミノ酸番号で表されるペプチド（n = 3、Uniprot: P05777）のH/D交換の平均パーセンテージ±SDを示しています。連続線は、MSによって連続的にペプチドがカバーされている領域を示す。膜結合ドメインとリボ核タンパク質（RNP）結合ドメインはグレーの網掛けと白線で示す。(B)データは、対応するpH 7のコントロールサンプルと比較した場合、pH 4に10秒または30秒暴露することによって誘導されるH/D交換割合の差を示す残差プロットとして示した。二峰性活性を示すペプチドは除外し、単峰性ペプチドのみをパネルBに示した。個々のデータポイントは、3連サンプルのH/D交換差の平均パーセンテージを示す。H/D交換の増加を示す目的のペプチドには1-6の番号を付けた。(C) pH 4曝露後にH/D交換の増加を示す選択したペプチド1-6の取り込みプロット。データは、30秒、300秒、3600秒のD2Oインキュベーション後の、pH7または4のサンプルのH/D交換の総パーセンテージを示す。データのポイントは、3連サンプルのH/D交換の平均パーセンテージ±SDを示す。データは二元配置分散分析（*P < 0.05、***P < 0.01、***P < 0.001、***P < 0.0001）により分析した。10秒pH曝露サンプルの比較に関する統計結果は表S2に示す）。(D) A/PR8 M1（PDB:7JM3）の結晶構造上にマッピングした、pH 4（対照pH 7と比較して）30秒後のH/D交換率の増加（赤）または減少（青）、あるいはH/D交換率の変化なし（灰色）を示すタンパク質領域。白はペプチドをカバーしていない領域を示し、二峰性の活性を持つペプチドはオレンジ色で示されている。パネルCのペプチド1-6の位置も番号で示した。(E)pH7群とpH4群の3連サンプルの代表的なスペクトル。D2Oインキュベーション時間の増加に伴う二峰性ペプチド204-218の質量シフトを示す。二峰性のピークは灰色とオレンジ色で分けられている。(F)左（グレー）と右（オレンジ）のピークの割合を時間と共にグラフ化。データはHDX-MSで分析した3連サンプルの平均±SDを示す。
秩序化されたNTDとは対照的に、α-ヘリックスH10からH12を含むCTDは、pH 4曝露後にH/D交換率が有意に増加した（図6BからD）。これらの結果は、X線小角散乱と原子間力顕微鏡を用いた過去の研究結果ともよく相関しており、M1の低pHによる構造変化は、CTDとN-CTD間のリンカー領域で最も顕著であることが示唆された(60)。ヘリックスH11の残基202-212を含むいくつかのペプチドもまた、中性条件下で二峰性の分布を示したが、これはpH 4にさらされた後に著しく顕著になった（図6EとF）。このH/D交換領域は、長距離構造変化を彷彿とさせ、酸性処理への暴露がαヘリックスからループ構造への移行を促進することを示唆している。隣接するヘリックスH11とは対照的に、ヘリックスH10とH12にEX1動態を示すペプチドがないことは、後者のヘリックスがより構造化されていることで説明できるかもしれない。実際、ヘリックスH10とH12はわずか30秒の重水素化で非常に高い重水素化レベルを示すのに対し、ヘリックスH11は重水素化緩衝液中で1時間インキュベートした後でも交換からより保護されている（表S5）。CTDで観察されたH/D交換率の差の大きさは、酸性pH処理によってα-ヘリカル構造が大きく展開することを示唆しており、隣接するM1分子のCTDとNTDの間に存在することが知られている分子内接触が破壊され(56)、M1シェルの部分的な分解につながる可能性がある。
考察
環境感染は、ウイルスが次の宿主と接触するのに十分な時間、感染性を維持することに依存している。非エンベロープウイルスは通常、エンベロープウイルスよりも安定であると考えられており(61, 62)、特に水性環境においてはそうである(63)。このように敏感であるにもかかわらず、多くのエンベロープウイルスは、排出された液滴やエアロゾルを主要な感染媒介として、効果的な環境感染を起こす。飛沫のpHが低いとエンベロープ型Φ6バクテリオファージが飛沫感染中に不活化されることが示されており（64）、エアロゾル粒子におけるIAVの不活化を促進する主な要因としてpHの低さが同定された（29）。このことは、低pHに曝されてから30秒以内に感染性IAV力価が5-log10以上低下するという感染性データ（図1B）からも裏付けられた。小さなエアロゾル粒子は室内空気中で急速に酸性化するが、大きなエアロゾル粒子ほど酸性化は遅いと予測される（図1A）。したがって、感染性IAVのキャリアはより大きなエアロゾル粒子が優勢である可能性がある。呼吸器ウイルスゲノムと感染性IAVの両方が、ヒトのエアロゾルでは粗いエアロゾルに比べ、5 µm以下の細かいエアロゾル粒子に濃縮されていることが分かっています（23, 65）。従って、IAVは小さなエアロゾル内に運ばれ、エアロゾルの呼気によってすぐに酸性条件にさらされる可能性が高い。
本研究では、このような酸性の微小環境が、環境感染中のIAVの構造に及ぼす影響について理解を深めることを目指した。特に、低pHがIAVの構造脂質、ゲノム、タンパク質成分に及ぼす影響に焦点を当て、ウイルスの迅速な不活性化を媒介するプロセスを調査した。エアロゾルに関連した病原体の不活性化につながるメカニズムを理解することは、公衆衛生にとって有用である。すべての実験は、多くの安定化タンパク質-タンパク質およびタンパク質-脂質相互作用が存在する自然のウイルス環境を模倣するために、精製分子ではなくウイルス全体を使って行われた。我々の全ウイルスのデータを総合すると、観察されたpHを介したウイルス崩壊に関連する時間経過において、脂質やゲノムではなく、ウイルスタンパク質が測定可能な変化を起こしていることが示された。マルチプレックス全ウイルスHDX-MSデータは、HA（図1および2）とM1（図6）タンパク質の両方がウイルス不活化のドライバーであることを指摘した。IAVの残りの構造タンパク質（M2、NA）と複製関連タンパク質（PA、PB1、PB2）は、ビリオンあたりのコピー数が少なすぎて、我々の全ウイルスHDX-MS法では分析できなかった。ウイルスのリボ核タンパク質は、低pH（〜5）で凝集することが以前発見されているが、この凝集はpH中和によってほとんど逆転した(66)。IAVゲノムの増幅領域も、我々の研究では低pH曝露による影響を受けず（図S3）、IAVゲノムセグメントを被覆するNPも、HDX-MS分析でpHによる構造変化を示さなかった（図5BおよびC）。従って、IAVの複製関連成分の構造的損傷が、酸性条件下で観察されたウイルス感染性の喪失に寄与しているとは考えにくい。
機能性データからも、酸性エアロゾル条件下でIAVが急速に不活化する主な原因として、HAのポスト融合型が早期に達成されることが確認された（Fig.） pHを介したHAの変化は文献によく記載されているが、この引き金となる条件はpH〜5.5でより長く、より高温のインキュベーションである。非常に速い時間スケール、周囲温度、そしてここで用いた実質的に低いpH（融合より1.5pH単位低い）にもかかわらず、HAは融合後状態へ移行することが示され、あるいは少なくともウイルスの付着と侵入を防ぐ安定な中間状態へ移行する引き金となった。他の研究では、融合前と融合後の中間のHA状態が報告されており(31, 43, 67 - 70)、そのいくつかは可逆的であるようだ(71 - 73)。特にβ-ループの保持された柔軟性と二峰性のH/D交換挙動（Fig. 3A to C）から、我々のpH暴露サンプルでは、HAが中間状態にあることが示された。これはBenhaimら(43)がpH暴露後の初期におけるH3N2 HAについて示したのと同様である。重要なことは、HDX-MS分析の前にわれわれのサンプルを再中和したことで、不可逆的な転移が起こり、酸性化後にウイルスの感染性が決定的に失われることが示されたことである。より長い曝露時間またはより高い温度（常温ではなく37℃）での追加実験は、我々の系におけるpH曝露後のβ-ループの柔軟性の程度を分類するのに役立つであろう。
興味深いことに、10秒でHAに検出された変化は、ウイルス力価が下がり続けているにもかかわらず、30秒では増幅されなかった(Fig. 2C)。したがって、HAが不活化の大部分を仲介しているように見えるが、M1への変化とそれに伴うカプシドの分解が、さらなる感染力価の低下を引き起こしている可能性がある。事実、Fig. 1Bの不活性化動態は2段階の動態に分類でき、pH暴露後0から10秒までの感染性の急激な初期低下と、それに続く30秒までのゆっくりとした減衰速度であった。クライオ電子顕微鏡による研究では、H3N2 IAVを低pHでインキュベートすると、一部のビリオンでは球形のビリオンの形態が失われ、ビリオンのエンベロープから離れたマトリックス層が崩壊または巻かれる一方、同じ懸濁液中の他のビリオンは形態に影響を受けず、マトリックスも分解可能であったことが報告されている(57, 71)。このことは、M1の分解が集団内のすべてのビリオンに同じ速度で影響するのではなく、一部のビリオンに影響することを示唆している。これはH1N1 A/WSN/33でも同様に観察され、低pH処理後のTEMでは、すべてではないが一部のビリオンが球形の形態を失っていた（図4A）。ビリオンの完全性アッセイ（図4B）は、溶解したウイルス粒子がpH曝露後30秒までに約2-log10のウイルス力価減少をもたらす可能性も示した。これは最初の10秒間で見られた3-log10の急激な減少を補足するもので、われわれはこれをHAの変化によるものと考えている。ここでは酸暴露の最初の〜30秒間が最も興味深かったが、その後の研究でより長い時間（例えば5分や30分）暴露した後のこれらのIAVタンパク質の状態を分類し、進行中の変化を評価することも有益であろう。
保護タンパク質や他の有機成分の存在など、他のエアロゾル因子と組み合わせて、エアロゾルpHの低さがIAVに及ぼす影響を決定するためには、本研究の限界があることを認めます。ここで使用した塩ベースのpH緩衝液は、IAVが生理的エアロゾル環境で浮遊しているであろうヒト患者の肺液や鼻液の複雑さと変動性を反映しておらず、これらは部分的な保護を提供し、HAおよび/またはM1に対する酸を介した構造変化を減少させる可能性があることを認識している。例えば、IAVは呼吸器ムチンに存在するシアル酸と容易に結合することが証明されている(74 - 76)。これらのムチンは気道の上皮細胞から分泌される保護粘液層の一部であり、呼吸器ムチンによるシアリル化糖鎖の提示はウイルスのおとりレセプターとして働くことを意図している(76, 77)。このIAV-ムチンの相互作用は、本来のIAV-宿主細胞の相互作用よりも弱く(78)、ウイルスNAの作用により可逆的であることが多い(74, 79)。したがって、このような一過性の相互作用が、宿主間のエアロゾル輸送中にウイルスを安定化させる可能性がある。実際、Hiroseらは、模擬胃酸（pH 2）中に浮遊させたIAVは急速に感染力を失うが、人工粘液と一緒にインキュベートすれば、少なくとも4時間は酸による不活化から保護されることを示した（80）。ムチンがエアロゾル関連ストレスによるIAVタンパク質の安定化を仲介できるかどうかは、今後の研究の焦点となるであろう。しかし、私たちの先行研究では、複数の呼吸マトリックスの保護効果は、pHが4の低いバルク溶液ではもはや機能しないことが示されている(29)。さらに、本研究の目的は、蒸発するエアロゾル内で、低pHの効果を他の要因（不活性化作用か防御作用か）から意図的に切り離し、メカニズム的な特徴を明らかにすることであった。
ここで使用したA/WSN/33株のpH感受性は、実験室適応株や臨床分離株の他の株(81)と同様であり、臨床株は一般的に作業が難しく、HDX-MS分析に必要な高力価まで増殖しないため、WSNを意図的に代用として使用した。しかしながら、主要なIAVタンパク質の塩基配列は、分離株や亜型によって、特にHAについては異なる可能性があることに注意することが重要である。選ばれたA/WSN/33実験株を用いて得られた情報が、より臨床的に関連するIAV分離株にも適用できることを確認するため、この作業の一環として単純なHA配列のアラインメントを行った。Figure S8は、2009年の豚インフルエンザパンデミックからの分離株に加えて、2023年に様々な地域から分離されたH1N1およびH3N2ヒトIAV株のパネルに対するA/WSN/33 HA配列のアラインメントを示している。HA配列全体について、含まれるすべての臨床H1N1株（A/California/07/2009パンデミック株を含む）をA/WSN/33にアライメントしたところ、79%の配列同一性が達成された。さらに、Fig. 2D のHDX-MSで同定されたペプチド1-6とHAのβループに関連する残基は、すべてA/WSN/33とこれらの循環H1N1株との間で比較的よく保存されており、わずかな塩基の変化が観察されただけであった。循環しているH3N2分離株をA/WSN/33にアラインメントした場合、40％という低い配列同一性が見られたが、異なるサブタイプではもっと低い配列同一性が予想された。H3N2株とH1N1株の主な抗原性の違いのひとつはHAタンパク質そのものであり、エピトープが大きく異なるため、一方に対するワクチンは他方には効かない。将来の研究で、H3N2株のHA部位がエアロゾル条件によって類似または異なる影響を受けるかどうかを調べることは興味深い。
さらに、A/WSN/33と、豚由来のH1N1、H1N2、H3N2株、鳥インフルエンザ株H5N1、H7N9、H3N8、H9N2を含む10種の動物IAV分離株についてもアラインメントを行った（図S9）。HDX-MSによって同定されたHAから得られる目的の特異的ペプチドについては、A/WSN/33と豚のH1株の配列はよく一致し、いくつかのペプチドでは鳥のH5N1と驚くほどよく一致した。HAおよび／またはM1特異的不活化メカニズムと、様々な動物株のpHに影響される重要なタンパク質部位に関する比較研究は、今回発表された研究のフォローアップとして興味深く重要であろう。
IAVの範囲を超えて、他の呼吸器系ウイルス（例えばMERS CoV、ライノウイルス、呼吸器合胞体ウイルスなど）が酸性エアロゾルpHの影響を同様に受けるかどうか、また空気中の感染性ウイルス量を減少させるための非薬物的介入として、広範に作用する空気処理が採用できるかどうかを決定することも興味深い。あるいは、高リスク環境において呼気エアロゾルの酸性化を促進し、ウイルスの不活化速度を高めるために、スプレーベースの治療薬を利用することもできる。先行研究では、フェレットモデルにおいて、IAV感染の影響を緩和するための低pH（～3.5）鼻腔スプレーの有効性を調査した。試験された鼻腔スプレーは単純な酸混合物（L-ピログルタミン酸、コハク酸、クエン酸、アスコルビン酸を含む）に基づいており、感染したフェレットに局所適用することにより、ウイルス誘発症状の重症度を下げ、ウイルスの排出を減少させた(82)。ここではHA上の複数のエピトープがpHに影響されることがわかったので、低pHによるIAV不活性化の非特異性は、このアプローチが現在の抗ウイルス剤よりも耐性化を起こしにくい可能性があることを意味する。IAVはまた、in vivoでの自然感染サイクルの進行におい て、酸性pHへの曝露に特異的に依存している。
全体として、ここで得られた情報は、屋内エアロゾル条件下でのIAVの自然不活性化メカニズムについての理解を深めるものである。全ウイルスHDX-MSは、これまでH3N2型IAV X-31株のHAタンパク質の特性解析にのみ使用されていた。我々は、IAVが全体的なタンパク質の変性によって不活化されたのではなく、エアロゾルに関連したpH4の条件下で、酸性宿主細胞のエンドソームによって誘導される変化と同様の、局所的な構造変化がHAに起こることを確認した。我々はまた、M1による不活化の新たなメカニズムを同定した。既存のIAV特異的HDX-MSデータを拡張し、インフルエンザウイルス株や亜型を追加することは、この分野全般にとって有益であり、例えば異なるHAやM1分子のpH感受性など、ウイルスタンパク質間のメカニズムの類似性／相違性を研究することができる。これは新興株の環境安定性と伝播リスクの予測、空気処理戦略の適合性の評価、あるいは中和抗体や抗ウイルス剤の有効性を予測するためのエピトープの柔軟性の比較に利用できる。
材料と方法
ウイルス株
IAV株A/WSN/33（H1N1亜型）をMadin-Darby Canine Kidney（MDCK）細胞（ThermoFisher）で増殖させた。細胞は、10％ウシ胎児血清（FBS；ギブコ）および1％ペニシリン-ストレプトマイシン10,000 U/mL（P/S；ギブコ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM；ギブコ）で維持した。コンフルエントなMDCK単層培養液を洗浄し、1% P/Sおよび1 µg/mL TPCKトリプシン（Sigma, T1426）を添加したOptiMEM（Gibco）中で72時間、感染多重度（MOI）0.001でIAVを接種した。感染した培養上清を2,500×gで10分間遠心分離して清澄化し、IAVをSW31Tiローター（ベックマン）またはAH-629ローター（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で112,400×g、4℃で90分間、30％スクロースクッションを通してペレット化した。ペレットはPBS（ThermoFisher、18912014）中に4℃で一晩かけて回収した。濃縮IAVストックは、プラークアッセイ（後述）により1.2×1010〜7.5×1011 PFU/mLで定量し、Qubit Protein Assay Quantification Kit（Life Technologies、Q33211）により5 mg/mLの総ウイルスタンパク質で定量した。
VSV G（Kerafast、EH1020-PM）の代わりにホタルルシフェラーゼ遺伝子を保有する組換え水疱性口内炎ウイルスストックを、VSV Gタンパク質（VSV-G）またはA/WSN/1933 HAおよびNA（VSV-H1N1）のいずれかで偽型化した。8×105HEK293T細胞/ウェルを6ウェルプレートに播種し、翌日ViaFect（Promega社、E4981）を用いて、Gタンパク質を発現するプラスミド4μg、またはHAを発現するプラスミド2μgとNAを発現するプラスミド2μgをトランスフェクトした。37℃で24時間インキュベートした後、細胞をDMEM中でMOI 4のVSV-G Lucストックに感染させた。37℃で1.5時間後、細胞をPBSで洗浄し、1μg/mLの抗VSV-G抗体（Kerafast、EB0010）を含むDMEMとともに37℃で24時間インキュベートした。これはVSV-H1N1ウェルのみに添加され、VSV-Gストックは抗体なしで作製されたことに注意されたい。上清を回収し、300×g、5分間の遠心分離で清澄化した。VSV-H1N1ストックはさらに、5 µg/mL TPCK処理トリプシン（Sigma-Aldrich、T1426）で37℃、20分間処理し、その後10 µg/mL Soybean Trypsin inhibitor（Sigma-Aldrich、T6522）で37℃、20分間トリプシンを不活化した。VSV-GおよびVSV-H1N1ストックは分注し、-80℃で凍結保存した。
プラークアッセイ
プラークアッセイは、12ウェルプレート内のMDCK細胞の単層を用いて実施した。IAVサンプルを「感染用PBS」（PBSi；1％P/S、0.02mM Mg2+、0.01mM Ca2+、0.3％ウシ血清アルブミン[BSA、シグマアルドリッチA1595]、最終pH～7.3を添加したPBS）で連続希釈してから、洗浄した細胞単層に添加した。ウイルスは、37℃、5% CO2、10分ごとに手動で攪拌しながら、単層培養器上で1時間インキュベートした。その後、接種液を除去し、0.5μg/mLのTPCK-トリプシンとアガロースを添加したMEMを細胞に加えた。感染プレートおよびコントロールプレートを5% CO2、37℃で72時間培養し、PBS+10%ホルムアルデヒド（Sigma, 47608-1L-F）で細胞を固定した後、水+10%メタノール（Fisher Chemical, M-4000-15）中の0.2%クリスタルバイオレット溶液（Sigma, HT901-8FOZ）で染色し、プラークを可視化した。
ウイルスの酸性化と中和
クエン酸粉末（Acros Organics, 220345000）とNa2HPO4粉末（Fluka Chemika, 71640）をそれぞれ0.1Mと0.2Mの濃度になるようにmiliQ H2Oに溶解した。0.1Mクエン酸溶液と0.2M Na2HPO4溶液をSigma Aldrich Reference System（https://www.sigmaaldrich.com/CH/en/technical-documents/protocol/protein-biology/protein-concentration-and-buffer-exchange/buffer-reference-center#citric）で指定されている方法で混合し、1×pH 4または7塩緩衝液を調製した。あるいは、濃縮した1 Mクエン酸と2 M Na2HPO4溶液を作り、同じ比率で混合して10×pH 4または7緩衝液を作製した。IAV感染性の分析には、1×pH緩衝液を使用してウイルスサンプルをpH調整した。精製IAVを1×pH 4またはpH 7緩衝液（最終濃度1×107 PFU/mLまたは1×108 PFU/mL）に1/100まで添加し、短時間ボルテックスして混合した後、周囲温度でインキュベートした。所定の時点でサンプルを採取し、PBSiで1/100に希釈してpHを中和した。あるいは、ウイルスの希釈を最小限にするため、3% 10×pH 7緩衝液を含むPBSiで1/10希釈して中和した。pH試験により、いずれの希釈方法でもpHが6.7～7.0に中和されていることが確認された。中和したサンプルは、残存感染力価を定量するためにプラークアッセイまたは蛍光アッセイで滴定する前に凍結した。
HDX-MS、脂質-MS、VSV分析、TEMイメージング、およびRNase Capsid Integrity Assayでは、精製ウイルスサンプルをpH 4または7に調整するために、10×pH緩衝液をウイルスサンプルに1:9の割合で添加した。この戦略により、ウイルスサンプル濃度を可能な限り高く保ちながら、pHを細かく調整することができた。例えば、pH 4に調整するために、1μLの酸性化バッファー（600mMクエン酸と800mM Na2HPO4からなる10×pH 4.0バッファー）を9μLのウイルスサンプルに加え、2秒間ボルテックスして混合した。これにより、サンプルのpHは7.3から4.0に低下します。IAV サンプルを中和するため、2.2 µL の 2M Na2HPO4 を 10 µL の酸性化ウイルス混合液に加え、2 秒間ボルテックスして混合しました。なお、非調整ウイルスと2M Na2HPO4を同じ比率で混合しても、IAV感染力価には影響しなかった（図S7）。VSVサンプルを中和するために、酸性化したVSVを3% 10×pH 7緩衝液を含むPBSiで1/10に希釈した。いずれの中和法もpHを6.7～7.0の中性pHに戻した。中性のコントロールサンプルについては、1μLの10×pH7.2緩衝液（160mMクエン酸および1.68M Na2HPO4）を9μLのウイルスサンプルと混合し、2秒間ボルテックスして混合し、模擬酸性化を行った。これにより、サンプルのpHは7.3から7.0に低下した。模擬中和のため、この10 µLに2.2 µLの10×pH 7.0緩衝液（130.5 mMクエン酸と1.74 M Na2HPO4）を加え、2秒間ボルテックスして混合した。これによりpHは7.0に保たれ、この戦略により、下流の分析に先立ち、中和されたpH 4とpH 7のサンプル間で塩濃度とウイルス濃度が同等であることが保証された。すべてのpH調整とインキュベーションは室温（22℃～25℃）で行った。
VSV 感染性分析
偽タイプのVSVの不活化を測定するため、サンプルを上記のように酸性化および中和し、その後、感染したMDCK細胞のルシフェラーゼ活性を測定することにより、侵入能力を試験した。そのために、3×104細胞/ウェルを96ウェルプレートに播種し、一晩培養した。翌日、細胞を洗浄し、50μLの中和VSVサンプルを37℃で1.5時間感染させた。細胞をPBSで洗浄し、10% FBSと1% P/Sを添加したDMEM中でインキュベートした。ルシフェラーゼ活性は、ONE-Glo Luciferase Assay System（Promega, E6110）とPerkinElmer EnVisionプレートリーダーを組み合わせて、感染後7時間で定量した。
感染細胞とウイルス粒子の蛍光イメージング
IAVサンプルは上記のように酸性化および中和し、最終濃度を1×107 PFU/mLとした。その後、サンプルを感染とその後の細胞内NPの染色、またはウイルス粒子の直接染色に使用した。酸性化後のウイルス侵入を評価するため、A549細胞を37℃で1時間、PBSiで希釈した中和IAVを感染多重度2（酸性化前の力価から算出）で感染させた。その後、細胞をPBSで洗浄し、P/S、0.2% BSA、20mM HEPES（Sigma-Aldrich、H7523）、および0.1% FBSを添加したDMEM中で2時間または5時間インキュベートした。感染細胞をPBS中3.7％ホルムアルデヒド（ThermoFisher Scientific, 26908）で15分間固定し、その後50mM塩化アンモニウム（Sigma-Aldrich, 254134）、0.1％サポニン（Sigma-Aldrich, 47036）、2％BSA（Sigma-Aldrich, A7906）を添加したPBS中で、RTで1時間ブロックおよび透過化した。一次マウスモノクローナル抗NP抗体（ハイブリドーマ上清、ATCC、HB-65）を、RTで1時間（必要に応じて4℃で一晩）適用した。細胞をPBSで洗浄し、結合した一次抗体を抗マウスIgG Alexa488（ThermoFisher Scientific、A-11029）を用いて検出した。感染細胞はDAPI（Sigma-Aldrich、10236276001）でも染色し、RTで1時間インキュベートした。
ウイルス粒子のHA構造を解析するため、150μLの中和IAVをカバースリップ上で1,000×gで30分間遠心した。次にウイルスサンプルを上記のように固定、ブロック、透過処理し、マウスモノクローナル融合後HA抗体（ハイブリドーマ上清、Wistar - Coriell Institute、Y8-10C2、融合後HAにより強く結合することが(83)で検証されている）とウサギポリクローナル抗NP抗体（J. Pavlovicの親切な贈り物、Institute of Medical Virology、Zurich、Switzerland）を用いてIAVを染色した。内部NPの染色では、すべてのケースで同量のウイルス物質が画像化されるようにした。染色したサンプルをPBSで洗浄し、抗マウスIgG Alexa546（ThermoFisher Scientific、A-11031）および抗ウサギIgG Alexa488（ThermoFisher Scientific、A-11008）を用いて結合抗体を検出した。PBSで洗浄後、カバースリップをProLong Gold Antifade Mountant（Thermo Fisher Scientific, P36930）でマウントした。染色したスライドと細胞を、SP8共焦点レーザー走査型顕微鏡（ライカ）またはDMi8顕微鏡（ライカ）とTHUNDER Instant Computational Clearing Algorithm（ライカ）を組み合わせて画像化した。
透過型電子顕微鏡
精製 IAV サンプルは、上述のように 10 × pH バッファーを用いて pH 調整および中和した。すべてのサンプルは、中和前に室温で 30 秒間 pH 暴露した。中和したサンプルを1×pH7.0緩衝液で1010 PFU/mL相当に希釈し、TEMに使用する前に0.06%パラホルムアルデヒドで4℃、4日間固定した。各固定試料5マイクロリットルをカーボンコート銅グリッド（Electron Microscopy Sciences, CF400-Cu）に蒸着した。グリッドは試料添加の直前にUV放電し、試料は室温で2分間吸着させた。余分な溶液はWhatmanフィルターペーパーでブロットし、グリッドはmiliQ水滴で洗浄した。その後、サンプルを5 µLの2%酢酸ウラニル（Electron Microscopy Sciences, 541-09-3）で1分間ネガティブ染色した。余分な染色をブロットし、グリッドを5分間自然乾燥させた。グリッドはTecnai Spirit TEM（スポットサイズ：2、エミッション：4.41 uA、加速電圧：80 kV）を用いて画像化した。
カプシド完全性のためのRNアーゼアッセイ
IAVサンプルは、1×pHバッファーを用いて、上記のようにpH調整と中和を行いました。サンプルは中和前に室温で30秒間pH曝露した。コントロールとして、ウイルスをPBSのみと混合し、室温で保持した。中和した全ウイルスサンプルとコントロールの全ウイルスサンプルを、RNase消化混合液［10mM Trisと1mM EDTAを含むTE緩衝液（Invitrogen, AM9858）、50mM NaClでpHを7.0に調整し、HClで補充］に1/100に希釈した。その後、RNase A/T1（Thermo-Scientific, EN0551）を40μg/mLのRNase Aと100U/mLのT1最終濃度まで添加した。） サンプルをボルテックスで混合し、37℃で30分間静置した。コントロールとして、同じ中和サンプルをコントロール消化混合物（RNase A/T1非存在下でTE緩衝液にPBSを加えたもの）に1/100に希釈し、ボルテックスし、RNase処理サンプルと一緒にインキュベートした。30分後、SUPERase-In RNase Inhibitor（Invitrogen, AM2694、RNase A, B, C, 1, T1に対して作用）を全サンプルに加え、室温で20分間インキュベートした。その後、QIAamp Viral RNA Mini Extraction Kit（Qiagen, 52906）を用いてRNAを抽出する前に、サンプルを-20℃で一晩凍結した。ウイルスRNAは分析まで-80℃で保存した。
RT-qPCR
増幅および検出は、IAV Mセグメントを標的とする以下のプライマー：フォワードプライマー5′-ATGAGYCTTYTAACCGAGGTCGAAACG-3′およびリバースプライマー5′-TGGACAAANCGTCTACGCTGCAG-3′を用いたOne Step PrimeScript RT-PCRキット（RR064A、タカラバイオ）を用いて行った。IAV検出用のRT-qPCR混合液は、2×One-Step SYBR RT-PCR Buffer 7.5μL、Takara Ex Taq HS（5 U/μLストック）0.3μL、PrimeScript RT酵素ミックス0.3μL、フォワードおよびリバースプライマー（10 uMストック）0.3μL、RNaseフリー水3.3μL、抽出RNAサンプル3μLであった。すべてのサンプル操作はバイオセーフティキャビネットの下で行い、ワンステップサイクリングプログラムには以下の条件を使用した： 逆転写と変性は50℃で2分、95℃で10分、アニーリングと伸長は95℃で15秒、60℃で60秒のサイクルを40回行い、最後に55℃から95℃まで0.3℃/秒で解離させた。定量には、(84)に記載されているように、Gブロック遺伝子断片の滴定を用いて標準曲線を作成した。すべてのRT-qPCR反応は二重反復で行い、各PCRランには常に陰性である非鋳型対照が含まれていた。サンプルの希釈により、実験プロトコールにおけるPCR阻害がないことを確認した。反応はBio Molecular Systems社のMic Real-Time PCR Systemを用いて測定した。
ResAMモデリング
多層ResAMは、呼気とその後の室内空気との平衡化に伴う呼気粒子内部の組成とpHの変化をシミュレートする［ResAMを用いたウイルス研究の詳細については、参考文献(29)を参照］。このモデルは、選択可能なサイズ（20 nm～1 mm）の粒子と、ヒトの呼吸器液、特に合成肺液を代表する有機および無機種からなる液相の計算を実行する。室内空気の条件は、20℃、相対湿度50％、濃度36.3ppb NH3、0.27ppb HNO3、600ppm CO2とした。
水素重水素交換質量分析法（HDX-MS）
精製IAVサンプルは、上記のように10×pH緩衝液でpH調整および中和した。サンプルは中和の前に、室温で10秒または30秒間pH曝露しました。重水素化中のpHシフトによる水素/重水素交換（HDX）速度の違いを避けるため、酸処理サンプルとpH7処理サンプルの中和後のpHが全く同じであることを確認するため、注意深くテストを行った。HDXを開始するために、中和した全ウイルスサンプルをD2O緩衝液（99%重水素酸化物、Sigma 151882、120mM NaCl添加）中でインキュベートした。40マイクロリットルのD2Oバッファーを、氷上で10μLの中和ウイルス（最終D2O濃度78%）ごとに、30秒、300秒、または3,600秒、3回繰り返した。各D2Oインキュベーション後、サンプルを氷冷クエンチバッファー［150 mMトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン-HCl（TCEP、Thermo-Scientific、PG82080）、2 M尿素（Sigma、U5128）、0.1％ギ酸（FA、Acros Organics、270480280）最終濃度、pH 2.5を含むmiliQ］に希釈してクエンチした。サンプルをあらかじめ冷却した4℃の遠心分離機で21,000×gで2分間スピンし、上清を直ちに液体窒素で瞬間凍結し、HDX-MSで分析するまで-80℃で保存した。非重水素化コントロールは、D2Oの代わりに120mM NaCl添加H2Oを用い、pH7とpH4の中和ウイルスを用いて同様に調製した。
重水素取り込みの定量
タンパク質への重水素取り込みを定量するために、タンパク質サンプルを解凍し、氷に浸したUPLCシステムに注入した。タンパク質を2本の固定化ペプシンカラム（Thermo, 23131）で消化し、ペプチドをVanGuardプレカラムトラップ（Waters）に回収した。続いてトラップを溶出し、C18、300Å、粒子径1.7 µm Fortis Bioカラム100×2.1 mmを用い、150 µL/分で20分かけて8-30%のバッファーBのグラジエントでペプチドを分離した（バッファーA：0.1%ギ酸、バッファーB：100%アセトニトリル）。質量スペクトルは、Orbitrap Velos Pro (Thermo)を用い、300℃、イオンスプレー電圧5 kVで作動するエレクトロスプレーイオン化源を用いて、400から2,200 m/zのイオンについて取得した。ペプチドは、MS/MS後のデータ依存取得によって同定され、データはMascotによって解析された。重水素取り込みレベルは、HD examinerソフトウェア（Sierra Analytics）を用いて定量し、すべてのペプチドの品質を手動でチェックした。結果は理論上の最大重水素化レベルに対するパーセンテージで示した。拡張結果は表S3からS5にある。2つの状態間の重水素化レベルの変化は、12%以上、0.6 Da以上、P < 0.05（対応のないt検定）の場合に有意とみなした。
全ウイルス脂質質量分析
精製したIAVサンプルをPBSで8×1010 PFU/mLに希釈し、pHを調整した後、上記のように周囲温度で30秒間pHに暴露して中和した。中和した全ウイルスサンプルを、ガラスピペットを用いてクロロホルム：メタノール（1：1混合物）で1/100に希釈し、2mLエッペンドルフセーフロックポリプロピレンチューブに入れた。サンプルを短時間ボルテックスして混合し、分析まで4℃で保存した。脂質抽出物は、島津 Prominence UFPLC xr システム（東京、日本）の HILIC Kinetex カラム（2.6 µm、2.1 × 50 mm2）で、流速 200 µL/min で 8 分間のグラジエントで分離した。移動相Aは10mMギ酸アンモニウムと0.5％ギ酸を含むアセトニトリル：メタノール10：1（v/v）、移動相Bは10mMギ酸アンモニウムと0.5％ギ酸を含む脱イオン水であった。溶出勾配は200 µL/minで5% Bから開始し、7分間かけて50% Bまで直線的に増加させ、50% Bで1.5分間保持し、最後にカラムを2.5分間再平衡化した。MSデータは、ハイブリッドOrbitrap Elite（Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany）を用いて高分解能でフルスキャンモードで取得した。システムは240,000分解能（m/z 400）で作動し、AGCは1.0E6に設定され、1マイクロスキャンは最大注入時間10msに設定された。加熱エレクトロスプレーソースHESI IIは、90℃、ソース電圧4.0KVでポジティブモードで操作した。シースガスおよび補助ガスはそれぞれ20および5任意単位に設定され、トランスファーキャピラリーの温度は275℃に設定された。
質量分析データはLTQ Tuneplus2.7SP2で取得し、Xcalibur 4.0QF2（Thermo Fisher Scientific）で処理した。脂質の同定は、Lipid Data Analyzer II (LDA v. 2.6.3, IGB-TUG Graz University) (85)を用いて行った。LDAアルゴリズムは、それぞれの保持時間、m/z、強度によってピークを同定する。質量精度が常に3ppm以下となるよう、装置の定期的な較正に注意を払い、それにより元素の割り当てには理論的にはわずかな可能性しか残さなかった。データの可視化は、EPFLでホスティングされている自作のウェブツールのLCMSexplorerで改善された。
統計分析
定量結果は平均値±SDで表した。2群のデータの比較にはStudent's t-testを用い、1つの独立変数を含む3群以上のデータの比較にはone-way ANOVAを用い、2つの独立変数によってデータをグループ化した場合にはway-way ANOVAを用いた。事後分析にはTukeyの多重比較検定を用いた。すべての解析はGraphPad Prism, version 9.4.0 (GraphPad Software, La Jolla, USA)を用いて行った。P値＜0.05（信頼度95％）を統計的に有意とみなした。
謝辞
本研究は、スイス国立科学財団（助成番号189939）の助成を受けて実施した。
HDX-MSサンプル取得を支援してくれたジュネーブ大学タンパク質プロテオミクスプラットフォームのRémy VisentinとAlexandre Hainardに感謝する。TEMイメージングを支援してくれたEPFL Interdisciplinary Centre for Electron Microscopy (CIME)のDavide Demurtasに感謝する。
著者らは、競合する利益や開示事項がないことを表明する。
補足資料
補足資料 - msphere.00226-23-s0001.pdf
図S1からS9、表S1とS2。
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表S3 - msphere.00226-23-s0002.xlsx
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表S4 - msphere.00226-23-s0003.xlsx
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モノリグノールのファイトアレキシングルコシルトランスフェラーゼへのサブ機能化は基質阻害を伴う
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鳥インフルエンザA（H7N9）ウイルスに対する二酸化塩素の効果
Zhiping Sunら、バイオセーフティと健康、2022年
RNAウイルスを用いた、組織培養をバイパスする高効率なコムギの遺伝性ゲノム編集
Tingdong Liら、Molecular Plant誌、2021年
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