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出版：2023年10月18日
非アルコール性脂肪性肝炎を合併した糖尿病マウスにおいて、腸管インスリン作用は肝発癌を予防する
https://www.nature.com/articles/s41467-023-42334-y


添田耕太郎、笹子孝義、...植木耕二郎 著者一覧を見る
ネイチャーコミュニケーションズ14巻、論文番号：6584（2023）この記事を引用する

メトリクス詳細

要旨
糖尿病は非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）や肝細胞癌（HCC）のリスクを高めることが知られている。我々は、低用量ストレプトゾトシンと高脂肪食（HFD）により糖尿病、NASHおよび肝細胞癌を発症する雄性STAM（STelic Animal Model）マウスに、インスリンまたはフロリジンを投与した。いずれの治療も高血糖とNASHを改善するが、インスリン治療のみでは、ディスバイオシスの改善と抗菌ペプチド産生の回復を伴って肝細胞癌を抑制した。糖尿病とNASHを合併したインスリン治療患者の微生物叢の変化には類似点がある。しかし、腸上皮細胞特異的にインスリン受容体を欠損させた雄性STAMマウス（ieIRKO）では、インスリン治療は肝細胞癌を抑制することができず、腸内バリア機能は低下していた。さらに、雄性ieIRKOマウスは単にHFDを行っただけでは肝細胞癌を発症しやすい。これらのデータは、腸管インスリンシグナルの障害が肝細胞癌のリスクを増大させ、糖尿病におけるインスリン作用の回復によってこれに対抗できることを示唆している。

はじめに
疫学的には、糖尿病は肝細胞癌（HCC）の独立した危険因子であると報告されている1。糖尿病はまた、肝細胞癌（HCC）の発症につながる非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）2の主要な危険因子の一つである。いくつかの抗糖尿病薬は、糖尿病または糖尿病予備軍3におけるNASHを抑制することが示唆されているが、糖尿病治療における特定の戦略が肝細胞癌の抑制につながるかどうかは、主に糖尿病に関連するNASHおよび肝細胞癌の病態生理学的メカニズムが十分に理解されていないため、依然として不明である。

2型糖尿病は、インスリン抵抗性とインスリン分泌の不十分な補正の結果として、標的臓器におけるインスリン作用の低下による慢性高血糖を特徴とする症候群である。インスリン抵抗性に対するインスリン分泌能は、民族によって異なる4, 5。実際、アジア人はインスリン分泌能が非常に低く、白人に比べて有意に低い肥満度（BMI）で糖尿病を発症し、インスリン抵抗性の程度も非常に低いことが示されており、糖尿病とNASH/HCCを合併しているアジア人のBMIも白人に比べて低いことが示されている。そのため、糖尿病と肝障害を有する患者にはインスリン治療がしばしば必要とされるが、多くの経口抗糖尿病薬は副作用のリスクを高めるため、これらの患者には使用できない。一方、インスリンはグルコース低下作用だけでなく、インスリン受容体シグナル伝達の細胞増殖作用も媒介するため、潜在性腫瘍の芽を成長させる可能性があり、発癌リスクのある糖尿病患者に対するインスリンの使用については議論がある。さらに、これまでの研究で、マウスにおけるインスリン受容体基質の肝細胞特異的破壊が、高脂肪食摂取によるジエチルニトロソアミン（DEN）による肝発癌を抑制することが示されており6、化学物質誘発性肝細胞癌の発症には、肝臓におけるインスリン作用が必要である可能性が示唆されている。さらに、がん細胞でしばしば誘導されるワールブルグ効果は、低酸素誘導因子-1（HIF-1）の活性化7を介したインスリンシグナルによって促進され、腫瘍に有利な微小環境をもたらす可能性がある。しかしながら、多臓器で媒介されるインスリンの全身作用が、この病態生理にどのように関与しているかは、まだ十分に理解されていない。したがって、NASHの進行と肝細胞癌の発症を予防するためには、糖尿病とNASHを合併した患者に対してどのような糖尿病治療が適しているかを、全身病態生理学的観点から明らかにする必要がある。

近年、腸内細菌叢が全身の代謝や糖尿病、肥満、NASH、肝細胞癌などの様々な疾患に影響を及ぼす因子であることが明らかになりつつある8。腸内細菌叢の組成は宿主のバリア機能に影響され、化学毒やウイルス、微生物の侵入を防ぐ役割を担っている。宿主と微生物の相互作用は、栄養摂取量9、肥満10、腸炎11、内服薬12など、宿主の体内状態と密接に関係している。例えば、以前の研究では、腸管上皮のインスリン受容体シグナルが、侵入微生物に対する化学的バリア機能を維持するために抗菌ペプチド（AMP）を分泌する腸管パネス細胞を支持している可能性が示唆されている13。

ここでわれわれは、糖尿病NASH-HCCモデルマウスと糖尿病およびNASH患者のサンプルを用いて、腸管バリア機能の維持とディスバイオシスの抑制に関連する、腸管におけるインスリンシグナルの肝発癌に対する保護的役割を実証した。

結果
STAMマウスは糖尿病合併NASH-HCCのモデルマウスである
近年、HCCを発症するNASH患者が増加しており14、糖尿病はこれらの疾患の共通の危険因子であることが示されている1。また、アジア人のNASH患者は白人患者とは異なり、比較的緩やかな肥満15を示すことが知られているが、これはおそらくアジア人の被験者が、著しい肥満と高インスリン血症を示す白人被験者よりも、脂肪肝炎に伴うインスリン抵抗性に対する代償的なインスリン分泌能が低いためであろう。ヒトのNASHおよび肝細胞癌の研究に利用できる様々なマウスモデルのうち、STAMマウス（STelic Animal Model mouse）は非肥満性糖尿病NASH-肝細胞癌モデルマウスであり、それぞれ9週齢と20週齢で肝線維化と肝細胞癌を発症する16（図1a）。STAMマウスは、出生時に少量（200μg/頭）のストレプトゾトシン（STZ）皮下注射を行い、離乳時から高脂肪食（HFD）を与えるというプロトコールに従って作製された16（図1a）。

図1：糖尿病性NASH-HCCモデルとしてのSTAMマウスの作製と特徴。
図1
実験プロトコル（a）。正常痩せマウス（Normal, n = 4）、食事誘導肥満マウス（DIO, n = 6）、STAMマウス（n = 6）の血糖値（b）および血漿インスリン値（c）（b, c）。データの値は平均値±SEMで表した。**p < 0.01、***p < 0.0001。一元配置分散分析、Tukeyの多重比較検定あり。正常痩せマウス(Normal, n = 4)、食餌誘導肥満マウス(DIO, n = 6)、STAMマウス(n = 6)の目に見える腫瘍の数(d)。データの値は平均値±SEMで表した（b、c、d）。*p < 0.05、**p < 0.01。一元配置分散分析、ダンの多重比較検定付き（b, c, d）。ソースデータはSource Dataファイルとして提供されている。正確なP値は補足データ3にある。

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STAMマウスは高血糖（図1b）、脂質異常症、および肝脂肪症を示したが、STZを注射しない高脂肪食負荷肥満マウス（食餌誘導性肥満[DIO]マウス）に比べ、高インスリン血症はHFD非投与の正常マウス（図1c）、肥満（補足図1a、補足図1b）、および肝脂肪症のレベルまで少なかった。

これまでの研究と同様に、STAMマウスではDIOマウスに比べて線維化が明らかであり、コラーゲン1の肝mRNA発現はSTAMマウスで上昇し（補足図1c）、肝線維化はSirius red染色によっても確認された（補足図1d）。STAMマウスの最も重要な特徴の一つは、高率の肝発癌を伴うことであった（図1d、補足図1d）。肝線維化および肝発癌に関連して、肝炎性サイトカイン（すなわち、Tnf-α、Ccl2およびIl-6）の発現は、DIOマウスと比較して、STAMマウスで上昇していた（補足図1c）。STZによって誘導された複数の体細胞突然変異は、肝腫瘍領域（補足図1e、f）だけでなく、STAMマウス肝臓の非腫瘍領域（補足図1g）でも見つかった。変異のシグネチャーはアルキル化剤によって誘導されるものと一致し（補足図1h）、いくつかの動物モデルの中でヒトのNASH/HCCのシグネチャーに最も近いことが示された17。これらのデータは、出生時のSTZ投与によって生じた特定の体細胞突然変異が、HCCが明らかになるまでSTAMマウスの細胞増殖によって維持されてきたことを示唆している。

従って、この動物モデルの特徴は、NASH/HCCを合併した非肥満性糖尿病の病態を調べるとともに、これらの疾患の患者に適した治療戦略を探る上で有用であると考えられる。

インスリン投与はSTAMマウスにおいて肝発癌を抑制したが、フロリジン投与は抑制しなかった。
インスリンは、糖尿病や肝機能障害のある患者に対して広く使用されており、時には唯一の選択肢となることもあるが、その一方で、インスリンが細胞分裂促進作用によって発癌リスクを高めるのではないかという懸念もある。一方、最近の研究では、SGLT2阻害薬のようなナトリウム-グルコース共輸送体（SGLT）を阻害することで、インスリン濃度を上昇させることなく尿中グルコース排泄を促進することで血糖値を低下させ、肝脂質蓄積を抑制することでNASHに有益な効果をもたらす可能性が示唆されている。糖尿病関連NASH/HCCの発症に対するこれら2つの異なるグルコース低下アプローチの効果を評価するため、STAMマウスにインスリンアナログ（インスリングラルギン）またはSGLT1/SGLT2阻害薬であるフロリジン（PHZ）を投与し、非投与のコントロールSTAMマウスと比較した（図2a、補足図2a、b）。

図2：STAMマウスにおけるインスリン投与による肝発癌抑制効果。
図2
薬物介入実験のプロトコール（a）。肝臓の顕微鏡像。HE染色とシリウスレッド染色（b）。スケールバーは100μm。HE染色によるNAFLD活性スコア（NAS）の評価（c）。**p < 0.01、***p < 0.001。一元配置分散分析（Dunnettの多重比較検定あり）。20週齢のマウスの腫瘍数（d）と最大径（e）。*P < 0.05. それぞれDunnの多重比較検定(d)とDunnettのT3多重比較検定(e)を用いた一元配置分散分析。20週齢の肝臓におけるCol 1の相対的mRNA発現レベル（f）。非処置STAMマウス（STAM-NON）n＝11、インスリン処置STAMマウス（STAM-INS）n＝12、フロリジン処置STAMマウス（STAM-PHZ）n＝12（c、d、e、f）。Col 1の発現レベルは、正常除脂肪マウス（n = 3, f）との比で示した。P値は一元配置分散分析（one-way ANOVA）とダンの多重比較検定（Dunn's multiple comparisons test）による（f）。9週齢のマウスの血糖値(g)と血漿インスリン値(h)。**p < 0.01, ****p < 0.0001。一元配置分散分析、Dunnettの多重比較検定あり。9週齢の肝臓における相対発現レベル(i)。STAM-NON n = 5, STAM-INS n = 4, STAM-PHZ n = 4 (g, h, i)。発現レベルはSTAM-NONマウス（i）との比で示した。*P < 0.05. 対応のない両側t検定。データの値は平均値±SEMで表した（c, d, e, f, g, h, i）。ソースデータはSource Dataファイルとして提供されている。正確なP値は、0.0001以下でない限り、補足データ3に記載されている。

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インスリンシグナルは肝臓での脂質合成を促進することが知られているが、本研究では、インスリン治療STAMマウスにおいて、20週齢時のNASHの病理学的悪性度、肝脂肪症（図2b、c、補足図2c-e）、線維化（補足図2f）、および肝発癌（図2d、e）の減少が見られた。一方、PHZを投与したSTAMマウスでは、SGLT2阻害剤を用いた先行研究18,19と同様に、NASHの病理学的悪性度が非投与のSTAMマウスに比べて有意に低下した（図2b, c, 補足図2c-f）。しかし、Col1の発現レベルは有意に低下せず、腫瘍の数と最大径も有意に改善しなかった（図2d-f）。対照STAMマウスと比較して、血漿中インスリン濃度は、インスリン投与STAMマウスでは有意に高値を示したが、PHZ投与STAMマウスでは有意な上昇は認められなかった。

インスリン投与マウスとPHZ投与マウスの結果から、インスリンシグナルには、グルコース低下作用の他に、肝細胞癌の発症や肝脂肪症・肝線維症に対する一定の保護作用があることが示唆された。

インスリン治療はSTAMマウスのNASHを複数の段階で抑制した
インスリンがSTAMマウスのNASHとHCCの進行を抑制するメカニズムを探るため、HCCが明らかになるまでに脂肪症における遺伝子発現プロファイルが大きな分岐を示すことを示唆した以前の研究16にならって、9週齢のSTAMマウスの脂肪症と線維症について遺伝子発現解析を行った。この時点では、体重および肝臓重量は、インスリンまたはPHZを投与したSTAMマウスと非投与のSTAMマウスとで有意差はなかった（補足図3a, b）。トリグリセリドの肝蓄積（補足図3c）はインスリンまたはPHZ投与により抑制されたが、コレステロールの蓄積は有意に抑制されなかった（補足図3d）。

肝脂肪症の発症には、1）肝臓での脂質合成の亢進、2）肝臓への脂質輸送の亢進、3）肝臓での脂質酸化の低下、の3つの機序が考えられる。肝臓におけるde novo 脂質合成の律速酵素である脂肪酸合成酵素（FAS）とアセチル-CoAカルボキシラーゼ（ACC）の発現は、インスリンシグナルによって制御されることが知られており20、実際、インスリン投与STAMマウスではFasの発現が上昇することが示されたが、FasとAccはともにSTZ非投与の高脂肪食マウスと比較して有意差はなかった（補図3e）。3e）から、肝臓におけるde novo脂質合成の制御は、STAMマウスの肝脂肪症の発症やインスリン投与によるその改善には主要な役割を果たしていない可能性が示唆された。次に、循環血液から肝臓への脂質流入に関与する因子を検討した。インスリン治療は、血漿NEFA濃度と精巣上体白色脂肪組織（eWAT）質量の減少を有意に抑制した（補足図3f, g）。eWATでは、リン酸化ホルモン感受性リパーゼ（HSL）もコントロールSTAMマウスでは上昇したが、インスリン投与により抑制された（補足図3h）。これらのデータから、STAMマウスでは、インスリン補充によってWATの脂肪蓄積機能が維持され、循環脂肪酸を抑制し、肝臓への取り込みが促進されたことが示唆される。以前の研究21と一致して、血漿NEFAの肝臓への取り込みは、ヒトでも示されたように、このモデルマウスにおける肝脂肪症に重要かもしれない。eWATでは、Ucp1もSTAMマウスで誘導され、インスリン治療によって減少した（補足図3i）。このことは、脂質の燃焼もeWAT質量の減少に関与していることを示唆している。脂肪酸トランスポーター（Cd36とFatp2）および脂質滴形成の重要な調節因子であるペリリピンの肝発現は、コントロールSTAMマウスで上昇し、インスリン治療により抑制された（補足図3j）。Cyp7b1とCyp27a1の発現には有意な低下がみられたが、Cyp7a1とCyp8b1の発現はDIOと比較してSTAMモデルでは有意な変化はみられなかった（補足図3j）。

一方、PHZ投与はWATのpHSLレベル（補足図3h）、NEFAの血漿レベル（補足図3g）、Cidec、Plin2、Plin3、Cd36の肝発現レベル（補足図3j）を抑制しなかった。もう一つの重要な輸送分子であるFatp2はSTAMモデルで誘導され、インスリンまたはPHZの投与によって抑制されたことから、両治療の効果への関与が示唆された。

これらのデータは、インスリンが糖尿病条件下で白色脂肪細胞における脂肪蓄積を維持することにより肝脂肪症を改善することを示唆しており、これまでの臨床研究22と一致している。

Real-time PCR解析により、STAMマウスの肝臓でCol1の発現が上昇している証拠も得られた。インスリン治療はCol1の減少とともに線維症の改善につながった（図2f）。PHZ投与はSTAMマウスの肝臓におけるシリウスレッド陽性領域も抑制したが（補足図2f）、Col1 mRNAの肝発現は抑制しなかった（図2f）。これらのデータは、インスリンシグナルがSTAMマウスのコラーゲン産生をタイトに抑制することを促進したことを示唆している。

炎症性サイトカインの発現についても検討した。Ccl2、Tnfa、およびIl6は、PHZを投与したSTAMマウスとは異なり、インスリン投与により有意に抑制された（図2i）ことから、慢性肝炎に対するインスリンシグナルの保護的役割が示唆された。

インスリン投与はSTAMマウスの肝臓における細胞増殖経路を抑制した
インスリンはPHZと同程度にSTAMマウスの肝臓におけるNASHの進行を抑制したが、異なる機序により、インスリン単独投与は肝細胞癌の発生を抑制した。そこでわれわれは、インスリンがSTAMマウスの肝発癌をどのように抑制するのかを調べようとした。

遺伝子オントロジー解析（Metascape、バージョン3.023）（補足図4a）により、STAMマウスの肝臓では、細胞分裂（GO 0051301; Log P値=-14）と有糸分裂細胞周期の制御（GO 0007346; Log P値=-6.5）がアップレギュレートされていることが示唆され、GO TRRUST（バージョン2）解析24（図3a）により、STAMマウスの肝臓ではワールブルグ効果が亢進しており、Hif-1αが上流制御因子の候補であることが示唆された。実際、Hif-1αの主要な下流因子であるPkm2とGls1は、STAMマウスで発現が上昇していた（図4b、補足図4b、c）。メタボローム解析（CE-TOF/MS）でも、TCAサイクルの後半部分（コハク酸、フマル酸、リンゴ酸）と前半部分（アセチルCoA、クエン酸、シスアコニット酸）の合計の比率が、STAMマウスの肝臓で有意に上昇していることが明らかになり（補足図4d, e）、ワールブルグ効果の存在と一致した。

図3：STAMマウスにおけるインスリン投与によるワールブルグ効果の抑制。
図3
3群のマイクロアレイ解析によって行われたGO TRRUST解析（a、各群n＝3）。9週齢の肝臓組織のウェスタンブロッティング解析（b）。実験は独立して少なくとも2回繰り返した。9週齢の肝臓におけるPkm2の相対的mRNA発現レベル（c）。非処置STAMマウス（STAM-NON）n=5、インスリン処置STAMマウス（STAM-INS）n=4、フロリジン処置STAMマウス（STAM-PHZ）n=4、*P < 0.05。2-sided unpaired t test (c)。コハク酸(Suc)、フマル酸(Fum)、リンゴ酸(Mal)、アセチルCoA(AcCoA)、クエン酸(Cit)、シスアコニット酸(Cis-Aco)の肝蓄積により算出した指標(d)。値は比率で示した。DIO n = 3, STAM-NON n = 3, STAM-INS n = 3, STAM-PHZ n = 3, CE-TOF/MSにより代表サンプルとして評価, 2-ヒドロキシグルタル酸の肝蓄積(e)。マロニルCoAの肝蓄積（f）。DIO n = 3, STAM-NON n = 3, STAM-INS n = 3, STAM-PHZ n = 3, CE-TOF/MSによる代表サンプルとして評価, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001, Dunnettの多重比較検定による一元配置分散分析(e, f)。データの値は平均値±SEMで表した（c、d、e、f）。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。正確なP値は、0.0001以下でない限り、補足データ3に記載されている。

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図4：インスリン投与によるSTAMマウスの腸管バリア機能障害および腸内細菌異常症の抑制。
図4
LC/MS分析により評価した肝臓中の代謝物のベン図（a）。非治療STAMマウス（STAMモデル、n=3）で正常マウス（Normal、n=3）よりも多く存在した代謝物（52代謝物）と、インスリン治療STAMマウス（n=3）（インスリン治療；37代謝物）よりも多く存在した代謝物（閾値倍率変化、2.0）の数。13代謝物が両方の基準を満たした(a)。13代謝物を凝縮し、それぞれの変化量をプロットした。二次胆汁酸は赤文字で示した（b）。正常痩せ型マウス（n = 4）、DIOマウス（n = 4）、STAMマウス（n = 5）の無処置群における各サンプルの全リード数に対する細菌の割合（c）。細菌は最大群平均で2％以上、非処置STAMマウス（STAM-NON）のリード割合は1％以上であった。*P < 0.05、**P < 0.01、両側対なしのt検定、通常 vs STAM-NON、# P < 0.05、両側対なしのt検定、DIO vs STAM-NON (c)。治療による変化（n＝4、インスリンまたはフロリジン、d）。*P＜0.05、両側対なしのt検定、STAM-NON vs STAM-INS、またはSTAM-NON vs STAM-PHZ（d）。処理によって抑制された細菌を選択した。Bacteroides massiliensis（e）、Bacteroides sartorii（f）、Crps（g）のqPCR解析。正常除脂肪マウス（n = 4）、DIOマウス（n = 4）、STAM-NON（n = 5）、インスリン治療STAMマウス（STAM-INS、n = 4）、フロリジン治療STAMマウス（STAM-PHZ、n = 4）、*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.00001、一元配置分散分析、Dunnettの多重比較検定付き（e, f, g）。データの値は平均値±SEMで表した（c、d、e、f、g）。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。正確なP値は、0.0001以下でない限り、補足データ3に記載されている。

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これらの所見とともに、Hif-1αのタンパク質発現の増加がウェスタンブロッティングによってすでに検出され（図3b）、pkm2 mRNAもまた、肝細胞癌が明らかになる前の9週齢の非処置STAMマウスにおいてアップレギュレートされていた（図3c）。メタボローム解析の結果、インスリン投与により代謝産物[Σ(Suc, Fum, Mal)/Σ(AcCoA, Cit, Cis-Aco)]とグルタミンの比率が低下したことから（図3d、補足図4f）、STAMマウスではワールブルグ効果が存在するが、インスリン投与により抑制されることが示唆された。

一次成分分析により、CE-TOF/MSにおける治療群間の包括的な代謝の違いが明らかになった（補足図5）。具体的には、メタボローム解析の結果、STAMマウスでは2-ヒドロキシグルタル酸（2-HG、図3e）とマロニルCoA（図3f）が蓄積し、インスリン投与により抑制されることが明らかになった。2-HGはオンコメタボライトとして知られており25,26,27、マロニルCoAはそれぞれ脂肪生成の基質として働く可能性がある。

インスリンは、STAMマウスにおけるマイクロバイオームの変化に関連した、強力ながん原性胆汁酸の蓄積を抑制した。
STAMマウスの肝臓において、液体クロマトグラフィー-質量分析（LC/MS）解析の結果、13の代謝物が正常およびインスリン治療STAMマウスの代謝物と比較して上昇することが明らかになった（図4a、補足表1、詳細はMethodsを参照、PCoAについては補足図6aを参照）。LC/MS分析では、デオキシコール酸とコール酸の比（DCA/CA）はSTAMマウスで増加し、インスリン投与によって抑制された（補足図6b）。

肥満に関連した肝細胞癌に関する以前の報告では、細菌叢が産生する二次胆汁酸が細胞老化を介して肝細胞癌の発生を促進することが明らかにされている8。そこで、通常のチャウを与えたマウス、STZを投与していない食餌誘導性肥満マウス（DIOマウス）、非投与マウス、インスリン投与マウス、PHZ投与STAMマウスの糞便DNAサンプルを用いて、16Sメタゲノム解析を行った。PCoAの結果、STAMマウスとDIOマウスの腸内細菌叢の構成成分に差があることが明らかになり（補足図6c）、STAMマウスとDIOマウスの腸内細菌叢の差は、インスリン非投与では部分的に保たれたが、PHZ投与では保たれなかった（補足図6c）。個々の細菌を評価した結果、STAMマウスではBacteroides massiliensisが2番目に多く（図4c、補表2）、この細菌の割合はインスリン投与により有意に抑制された（図4d、e、補表3）。3番目に多く存在し（図4c）、遺伝学的にB. massiliensisに近いBacteroides sartoriiの割合も同様のプロフィールを示した（図4d, f）28。一方、B. massiliensisとB. sartoriiの割合は、PHZ処理では抑制されなかった（図4d-f）。PCoAと個体解析のデータの関連性から、これらの細菌はこのモデルマウスにおけるディスバイオシスの良いマーカーになりうることが示唆された。この細菌は、データベース（PATRIC 3.6.12, Bacteroides massiliensis B84634 = Timone 84634 = DSM 17679 = JCM 13223）に基づいて、タウリンまたはグリシンが結合した一次胆汁酸の脱共役を担う胆汁酸塩加水分解酵素（BSH）を持つことが報告されており、二次胆汁酸産生の基質供給に関与している可能性があるが、菌の接種が困難なため実験的には確認されていない。

腸内細菌叢に影響を与えうる腸管ケミカルバリア機能因子のうち、Crps（クリプトジン、α-ディフェンシン）は回腸でインスリン投与により発現が上昇したが、PHZ投与ではその傾向は見られなかった（図4g）。さらに、DIOマウスではCrpsの発現が抑制される傾向がみられ、DIOマウスにおける腸管上皮のインスリン抵抗性を示した以前の研究29からも支持された。これらのデータから、インスリンシグナルが回腸のいくつかの抗菌ペプチド（AMP）をアップレギュレートし、B.massiliensisの割合に影響を与えている可能性が示唆された。

STAMマウス（補足図7a）で増加したリポ多糖（LPS）のような他の肝炎の潜在的な促進因子は、物理的なバリア機能障害や腸の漏出によって誘導される可能性がある。DIOマウスと正常マウスの比較と同様に、STAMマウスではDIOマウスと比較して、経口投与後にフルオレセインイソチオシアネート-デキストラン4 kDa（FD-4）の増加が観察され（補足図7b, c）、インスリンの補充では回復しなかった（補足図7d）。これらのデータは、インスリンが物理的バリア機能ではなく、化学的バリア機能を促進し、それによって腸内細菌叢を改善することを示唆している。

糖尿病患者およびNASH患者では、STAMマウスと同様の腸内細菌叢のシグネチャーが認められ、それはインスリン治療によって維持された。
STAMマウスで観察された腸内インスリン作用の低下によるものと思われる腸内細菌叢異常が、糖尿病やNASH患者にも関連するかどうかを評価するために、糖尿病とNASHを合併した患者の糞便DNAサンプルを用いて16Sメタゲノム解析を行った。糞便サンプルは、東京大学医学部附属病院消化器内科に入院中の患者27名（男性15名、女性12名）から採取し、肝生検により病理診断を確定した。このうち20例（男性13例、女性7例）は糖尿病とNASHの両方を合併しており、Matteoni class 4またはNASH-LCに分類された。これらの患者の検体を以下の解析に用いた（図5a）。彼らの平均年齢は68.0歳（図5b）、平均BMIは29.4（図5c）であり、STAMマウスの特徴と同様に、インスリン抵抗性とインスリン分泌の不十分な補正の両方が存在することが示唆された。補足資料に示した臨床的特徴（年齢、性別、BMI、AST、ALT、総コレステロール、トリグリセリド、病理学的悪性度）では有意差は認められなかった（補足表4）。経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）、血漿中デオキシコール酸およびコール酸に関する情報は、データが不十分であったため統計的比較は行わなかったが、補足表5に示した。

図5：糖尿病NASH患者におけるインスリン使用による16Sメタゲノムシグネチャーの変化。
図5
ヒト糖尿病NASH患者の腸内細菌叢を評価するための参加者選択の概略プロトコール（a）。全参加者の年齢（b）と肥満度（BMI）の分布（c）。非インスリン治療（インスリン未使用、n=15）およびインスリン治療NASH患者（インスリン使用、n=5）におけるBacteroides vulgatus（CP000139）の全リード数に対する割合（d）の対数10。データの値は平均値±SEM（d）で表した。*P＜0.05、Welchの補正を加えた両側対応のないt検定（d）。ソースデータはSource Dataファイルとして提供されている。正確なP値は、0.0001以下でない限り、補足データ3に記載されている。

フルサイズ画像
バイアスを補正したマイクロバイオームの組成解析2（ANCOM-BC230、補足図8a、補足表7）やバクテロイデス・マッシリエンシスそのもの（補足図8b、c）、多様性（補足図8d-f）には有意な変化は見られなかったが、遺伝的に類似したもう1つの細菌であるバクテロイデス・バルガトゥスの存在量には有意な変化が見られた（図5d、対応のないt検定）。この細菌に注目したのは、バクテロイデス属細菌の存在量とインスリン使用との関連性を示唆する過去の報告31や、バクテロイデス属細菌の存在量とバクテロイデス属細菌の存在量との遺伝的類似性を示す報告32を参照することができたからである。さらに、Bacteroides vulgatusは脂肪肝患者の腸内細菌叢で増加することも知られている33, 34。マウスとヒトの間でも宿主嗜好性が想定される。

抗生物質治療または糞便微生物叢移植はSTAMマウスの肝細胞癌の発症を抑制した
STAMマウスの肝細胞癌発症に及ぼす腸内細菌叢異常症の影響を評価するため、STAMマウスにアミノベンジルペニシリン（ABPC）、ネオマイシン（NEO）、バンコマイシン（VCM）の3種類の抗生物質を経口投与し、腸内殺菌を行った（図6a）。

図6：STAMマウスにおける3種の抗生物質の連続投与または糞便微生物叢移植（FMT）による肝発癌の抑制。
図6
STAMマウスの三種抗生物質投与（アンピシリン、ネオマイシン、バンコマイシン；3Abx）の実験プロトコール（a）。各群のマウスのBacteroides massiliensisの割合（b）、肝臓の代表的な巨視的外観（c）、可視腫瘍数（d）および最大径（e）を読み取る。コントロール（STAM）n＝14、3Abx（STAM）n＝12、*P＜0.05、***P＜0.001、***P＜0.0001、両側対なしのt検定による（b、d、e）。スケールバーは10mm。正常マウスからの糞便微生物叢移植（FMT）の実験プロトコール（f）。各群のマウスのBacteroides massiliensisの割合（g）、肝臓の代表的な巨視的外観（h）、可視腫瘍数（i）および最大直径（j）を読み取る。コントロール（STAM）n = 6、ノーマルからのFMT n = 5、*P < 0.05、***P < 0.0001、両側対なしのt検定による（g、i、j）。スケールバー、巨視的画像は10mm。STAMマウスからのFMTの実験プロトコール（k）。各群のマウスのBacteroides massiliensisの割合（l）、肝臓の代表的な巨視的外観（m）、可視腫瘍数（n）および最大直径（o）を読み取る。コントロール（STAM）n = 7、STAMからのFMT n = 10、両側無対t検定（l、n、o）。スケールバーは10mm。データの値は平均値±SEMで表した（b, d, e, g, i, j, l, n, o）。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。正確なP値は、0.0001以下でない限り、補足データ3に記載されている。

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リアルタイムPCR分析により、ほとんどの細菌が枯渇していることが確認され、16 S rDNAの相対量はコントロールの30分の1近くまで減少した（補足図9a）。massiliensisは、この病的病因のプロモーターと疑われるBacteroidetes>Bacteroidia>Bacteroidales>Bacteroidaceae>Bacteroidesという所属分類とともに、この3種の抗生物質処理によって著しく抑制された（図6b）。これらの変化は、トリグリセリド（補足図9h）とコレステロール（補足図9i）の肝蓄積に変化はなかったが、血中グルコース（補足図9g）の有意な減少を伴っていた。抗生物質投与群では、目に見える腫瘍の数（図6c, d）および最大径（図6e）が有意に抑制され、STAMマウスの腸内細菌叢における特定の細菌の寄与を支持した。

次に、B. massiliensisは厳密な嫌気性菌であるため接種が困難であることを考慮し、糞便微生物叢移植（FMT）を行った32。腸管滅菌後の正常マウスからのFMT（図6f）により、B. massiliensisは有意に抑制されたが（図6g）、DCA8の産生が疑われるClostridium cluster XIは抑制されなかった（補足図10a）。マウス個体の最大径および腫瘍数は、FMTにより血糖値（補足図10a）とともに有意に抑制された（図6h-j）。

第三に、STAMマウスからSTAMマウスへのFMT（図6k）は、B. massiliensisの割合（図6l）、肝発癌（図6m-o）および血糖値（補足図10b）を抑制しなかった。これらの実験では、トリグリセリドもコレステロール蓄積も有意な変化は観察されなかった（補足図10a, b）。これらのデータは、通常の細菌叢では抑制されている特定の細菌が、STAMマウスでは肝臓での腫瘍の発生を促進したことを示唆している。

さらに、STAMマウスの肝腫瘍発生における胆汁酸ヒドロラーゼ（BSH）の役割を明らかにするために、二次胆汁酸の脱共役を阻害するBSH阻害剤をSTAMマウスに投与した（補足図10c）。この化合物（GR-7; Gut restricted-735）を投与したところ、STAMマウスの肝腫瘍数は傾向的に減少し（P = 0.05、補足図10d）、Bacteroides massiliensisも有意に減少した（補足図10e）。この実験では、ビヒクルとしてシクロデキシトリンを用いる必要があったが、これはAkkermansia muciniphilaの増加につながる可能性がある（補足図10f）。この種の増加は肝脂肪症を改善することが以前に報告されている36 ので、ビヒクル処理は有益な効果をもたらし、それによって処理による差を減少させるかもしれない。

これらのデータは、B. massiliensisを含むある種の細菌が、このモデルにおいて肝腫瘍の発生を促進した可能性を支持するものであるが、具体的な機序を示すためには、gnotobiotic実験が必要である。

腸管上皮特異的インスリン受容体ノックアウトは腸管バリア機能に障害をもたらした
上記の結果から、腸管インスリンシグナル伝達がSTAMマウスにおける腸管機能異常と肝発癌の抑制に極めて重要な役割を果たしているという仮説が導かれた。この仮説を検証するために、腸管上皮特異的インスリン受容体欠損マウス（Villin-Cre; IR-flox, ieIRKOマウス）を作製し、インスリン投与時のバリア機能を解析した（図7a）。その結果、ieIRKO-STAMマウスでは、Villin-Cre-/-; IR-floxマウスに比べて、インスリン受容体（InsR）mRNAの発現レベルが著しく抑制されていることが確認された（補足図11a）。

図7：STAMマウスにおける腸管上皮インスリン受容体を介したAMP発現のアップレギュレーション。
図7
腸管上皮インスリン受容体ノックアウトSTAM（ieIRKO-STAM）マウスのインスリン投与実験プロトコール（a）。回腸のHE染色（b）とPAS-アルシアンブルー染色（c）。qPCRによる回腸AMP（d）とCrps（e）の相対発現レベル。コントロール-DIO n = 7、インスリン非投与コントロールSTAMマウス（コントロール-STAM-nonINS） n = 5、インスリン投与コントロールSTAMマウス（コントロール-STAM-INS） n = 11、インスリン投与ieIRKO-STAMマウス（ieIRKO-STAM-INS） n = 10、*P < 0.05、***P < 0.001、***P < 0.0001、一元配置分散分析によるqPCR解析、隣接2群間のŠídákの多重比較検定。n = 12, *P < 0.05, Defa22、Defa20、Defa3、Defa5、Defa26、Defa23、Defa24についての両側Mann-WhitneyのU検定。#P<0.05、Defa21(f)については両側対応のないt検定。データの値は平均値±SEMで表した（d、e、f）。ソースデータはSource Dataファイルとして提供されている。正確なP値は、0.0001以下でない限り、補足データ3に記載されている。

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インスリン投与は、コントロールSTAMマウスおよびieIRKO-STAMマウスの血糖値を有意に改善し（補足図11b）、体重を増加させ（補足図11c）、精巣上体脂肪組織重量を増加させた（補足図11d）。

STAMマウスの回腸では、顕微鏡的解析により、陰窩における好酸球性顆粒の減少とアルシアンブルー陽性顆粒の減少が認められ、これらはSTAMマウスではインスリン投与により改善したが、ieIRKO-STAMマウスでは改善しなかった（図7b, c）。これらのクリプト顆粒における顕微鏡的所見は、Paneth細胞における抗菌ペプチド（AMP）を示すものであり、ieIRシグナル欠損はPaneth細胞におけるAMP産生の機能障害をもたらすことが示唆された。

インスリン投与STAMマウスで非投与STAMマウスおよびインスリン投与ieIRKO-STAMマウスに比べて発現が上昇した遺伝子を含む遺伝子リストを用いた機能アノテーション解析 [The Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID) v6.8]（補足図11e、詳細はMethodsを参照）では、AMPとの強い関連が示唆された。また、Real-time PCR解析により、α-ディフェンシンの全ゲノムサブタイプ（Defa3、Defa5、Defa20、Defa21、Defa22、Defa23、Defa24、Defa26）およびCrpsが、STAMマウスではインスリン投与により有意に発現上昇することが明らかになったが、ieIRKO-STAMマウスでは、インスリン投与によるこれらの遺伝子の発現上昇は観察されず、インスリン投与したコントロールSTAMマウスとは異なっていた（図7d、e、補足図12b、c）。他のよく知られたバリア因子、Lyz1、Mmp7、Reg3g、pIgR、Occludin、Zo-1、Muc2は、インスリン投与によって有意に上昇することはなかった（補足図11f）。ieIRKOマウスと同腹のコントロールマウスを同一条件下（DIO、STAM、インスリン処理STAM、補足図12a）で比較すると、ieIRKOマウスでは摂食・投与条件にかかわらずAMPの発現抑制が観察されたが、高インスリン血症のコントロールDIOとSTAM-Insでは発現亢進が観察された（補足図12b、c）。

一方、インスリン投与したieIRKO-STAMマウスでは、インスリン投与したコントロールSTAMマウスと比較して、大腸が短縮する傾向（P = 0.09；補足図13a）と有意に減少した大腸重量（補足図13b）が認められ、大腸においてもIRのノックアウトが確認された（補足図13c）。大腸における既知のバリア因子、Defb1、Defb4、Occludin、Zo-1、Muc2、pIgR（補足図13c）の発現プロファイルは、個々のタイプのマウスのインスリンシグナル伝達やバリア機能のいずれとも相関していない可能性がある。

回腸に対するインスリンの直接作用を解明するために、生体外インスリン刺激実験37が行われた。4時間のインスリン刺激により、Defa22、Defa20、Defa21が有意に上昇し（P < 0.05）、Defa3、Defa5、Defa26も同様の傾向を示した（P < 0.10）ことから、α-ディフェンシンが回腸でインスリンにより直接誘導されることが示唆された（図7f）。

細胞内インスリン受容体シグナル伝達カスケードにはAkt/PKB29が含まれることが報告されている。TSC2はmTORC1シグナル伝達を抑制する主要なメディエーターの一つである。そこで、インスリン受容体の下流におけるこのシグナル伝達経路の役割を評価するために、腸上皮Akt1およびAkt2二重欠損マウス（ieAkt1/2DKO）および腸上皮Akt1、Akt2およびTSC2三重欠損マウス（ieAkt1/2TSC2TKO）を用いた回腸遺伝子発現解析を行った。ieAkt1/2DKOマウスでは、リン酸化Akt（pAkt）とmTORC1シグナルのマーカーであるリン酸化リボソームタンパク質S6（pS6）の減少が観察された（補足図14a）。ieAkt1/2DKOマウスでは、AMP産生の有意な抑制も検出された（補足図14b）。ieAkt1/2TSC2TKOマウスでは、pAktの減少にもかかわらずpS6の蘇生が観察され（補足図14c）、AMP産生の蘇生も起こった（補足図14d）ことから、Akt-TSC2/mTORC1シグナルは腸上皮におけるAMP産生を促進することが示唆された。

インスリン投与はieIRKO-STAMマウスの肝細胞癌を抑制できなかった
次に、16Sメタゲノム解析を行った。インスリン非投与STAMマウス、インスリン投与STAMマウス、インスリン投与ieIRKO-STAMマウスの16Sメタゲノムプロファイリングから、インスリン投与は腸管上皮のインスリンシグナル不全によって誘導されるディスバイオーシスを緩和することが強く示唆された。特に、STAMマウスではBacteroides massiliensisの発現が上昇し、インスリン治療により正常化したが、ieIRKO-STAMマウスではインスリン治療により低下しなかったことから、Bacteroides massiliensisの量は腸のインスリンシグナルにより制御されていることが示唆された（図8a、補足図15a）。バクテロイデス類に対するインスリンの抑制効果は、ファーミキューテス類に対する効果と同様に、ieIRKO-STAMマウスでは有意にキャンセルされた（補足図15b）。さらに、菌種レベルでは、対照STAMマウスではインスリン投与により抑制された細菌が、ieIRKO-STAMマウスではインスリン非投与の対照STAMマウスのレベルまで増殖した（補足図15c）。

図8：STAMマウスにおける腸管上皮インスリン受容体を介したdysbiosisの維持と肝発癌の抑制。
図8
16Sメタゲノム解析により決定したBacteroides massiliensisのリード数（a）。インスリン非投与対照STAMマウス（Control-STAM-nonINS）n＝7、インスリン投与対照STAMマウス（Control-STAM-INS）n＝11、インスリン投与腸管上皮インスリン受容体ノックアウトSTAMマウス（ieIRKO-STAM-INS）n＝10。各マウスから採取可能な新鮮な糞便サンプルからDNAを抽出した。各群の代表的肝臓の巨視的画像と顕微鏡的外観（HE、シリウスレッド染色）(b)。スケールバー、巨視的画像は10mm、顕微鏡画像は100μm。各マウスの腫瘍数（c）と最大径（d）。LC/MSで測定した肝臓中の代表的なデオキシコール酸（DCA）/コール酸（CA）比（e）。Col1の相対的mRNA発現レベル（f）。Control-STAM-nonINS n = 5, Control-STAM-INS n = 11, ieIRKO-STAM-INS n = 10, *P < 0.05, **P < 0.01, 一元配置分散分析、多重比較検定あり。図8eでは、Control-STAM-non-INS n = 4、Control-STAM-INS n = 6、ieIRKO-STAM-INS n = 6。*P < 0.05、両側Mann WhitneyのU検定。データの値は平均値±SEMで表した（a、c、d、e、f）。ソースデータはSource Dataファイルとして提供されている。正確なP値は、0.0001以下でない限り、補足データ3に記載されている。

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インスリン治療によるマイクロバイオームの変化と並行して、インスリン治療は対照STAMマウスの腫瘍数を有意に減少させたが、ieIRKO-STAMマウスでは減少させることができなかった（図8b-d）。遺伝子型間のインスリンに対する反応の違いは、腫瘍の最大径の違い、およびDCAの肝蓄積の違いと関連していた（図8e、補足図15d、15e）。

インスリン治療を行ったコントロールSTAMマウスとieIRKO-STAMマウスの背景肝トリグリセリドおよびコレステロール蓄積量（補足図15f）と肝重量（補足図15g）は同等であった。インスリン投与によりCol1の発現レベルは抑制されたが、ieIRKOマウスでは抑制されず（図8f）、このことはSirius red染色（図8b）からも支持された。インスリン治療ieIRKO-STAMマウスにおける肝障害は、肝臓におけるTnf-α、Ccl2、Il1bのmRNA発現（それぞれ、インスリン治療STAMマウス対インスリン治療ieIRKO-STAMマウス、P = 0.09、P < 0.05、P < 0.05；補足 Fig. 15h）、肝臓16 S rDNAの発現上昇（有意ではなかったが、平均2.3倍変化；補足図15i）も、インスリン治療ieIRKO-STAMマウスにおける細菌トランスロケーションの増加を示唆している。

STAMマウスモデルは容易に入手できるという利点があるが、全エクソーム配列決定で示されたように、DNA損傷アルキル化剤であるSTZの独立した発癌作用は否定できない。そこで、ieIRKOマウスと対照マウスに高脂肪食を18ヵ月間与え、より生理的な条件下で追加実験を行った。この実験では、肝腫瘍の最大径（図9a、c）および血漿中α-フェト蛋白濃度（図9d）は、ieIRKOマウスが対照マウスよりも有意に高かったが、腫瘍の数は同程度であった（図9b）。これらのマウスに普通食を与えたところ、肝腫瘍はほとんど認められなかった（補足図16a, b）。従って、ieIRシグナルはHFD摂食に関連した肝発癌への圧力に対抗する役割を果たしている。また、HFD摂食背景のieIRKOマウスの回腸では、InsR（図9e）、Crps（図9f）、Defa3、Defa21、Defa23、Defa26（補足図16c）の発現レベルが有意に抑制されていることが確認された。これらのマウスの16 Sメタゲノムプロファイリングから、ieIRKOマウスではコントロールマウスに比べてプロテオバクテリア門の割合が有意に高く、dysbiosisが示唆された（補足図16d）。

図9：高脂肪食を与え続けたieIRKOマウスの18ヵ月齢時の表現型。
図9
肝臓と回腸の代表像（a）。肝臓切片はHEおよびSirius redで染色した。回腸切片はHEとPAS-ABで染色した。スケールバー、巨視的画像は10mm、顕微鏡画像は100μm。各マウスの肝臓における可視腫瘍数（b）と最大径（c）。血漿α-フェトプロテイン（d）。InsR（e）とCrps（f）の相対的mRNA発現。コントロール（n＝5）およびieIRKO（n＝6）（b、c、d、e、f）、*P＜0.05、***P＜0.0001、両側Mann WhitneyのU検定（b、c、d）、および両側対応のないt検定（e、f）。データの値は平均値±SEMで表した（b、c、d、e、f）。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。正確なP値は、0.0001以下でない限り、補足データ3に記載されている。

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これらのデータを総合すると、腸管上皮細胞におけるインスリン作用が、糖尿病およびNASHに伴う肝細胞癌の発生に対して保護的な役割を果たしていることが示唆される。

考察
糖尿病と疫学的に関連する種々の癌の中で、肝細胞癌は糖尿病と関連する最も高い相対リスクの一つである1。一方、最近の研究では、NAFLD/NASH患者の肝細胞癌発症数が増加していること14が明らかにされている一方、ウイルス性肝炎の患者数は減少の一途をたどっている。糖尿病がNAFLD/NASHの強力な危険因子であることが知られていることから、糖尿病の管理は肝細胞癌の発生を抑制するために不可欠であると考えられる。

NASH-HCCの研究に利用できる動物モデルは数多くあるが38、遺伝子操作に伴う病的肥満を示すものもあれば、インスリン抵抗性や糖尿病とは無関係に特定の化学物質や食事によって誘導されるものもある。したがって、ほとんどのモデルは、糖尿病を合併したNASH/HCCの病態の解明や治療戦略の開発を目的とした研究には不適切である。さらに、これまでの疫学的研究から、アジア人で糖尿病やNASHを発症した被験者の肥満度は白人よりも軽度であることが示されており15、また、おそらく両民族間の糖尿病の病態の違いにより、アジア人はインスリン抵抗性に対してインスリン分泌能が低いことが示されている4,5。

この点で、出生時に低用量のSTZを注射し、離乳期から高脂肪食（HFD）を与え続けることで糖尿病、NASH、肝細胞癌を発症するSTAMマウス16は、糖尿病に伴うNASH/肝細胞癌の発症機序や治療戦略を探るための優れたモデルであると考えられる。実際、インスリン抵抗性とインスリン分泌の減弱を示すSTZとHFDで処置したマウスは、2型糖尿病のモデルとして広く用いられている39,40,41,42。さらに、これまでの研究で、STAMマウスの腫瘍における体細胞突然変異のシグネチャーは、ヒトのNASHに伴う肝細胞癌のシグネチャーと類似していることが証明されている43。本研究でも、腫瘍と非腫瘍の両領域で共通の体細胞変異シグネチャーが確認され、これらの変異がドライバー変異であることが示唆された。したがって、高血糖はSTAMマウスの肝細胞におけるドライバー変異を持つ肝細胞癌のプロモーター候補である可能性がある。しかし、SGLT1/2阻害薬であるPHZは、インスリン分泌や作用を増強することなく高血糖を改善するが、STAMマウスでは肝細胞癌を抑制できなかった。このことは、高血糖の改善だけではSTAMマウスや糖尿病・NASH患者の肝細胞癌を予防するには不十分であることを示唆している。以前の研究では、いくつかの病的肥満齧歯類モデルにおいて、SGLT2阻害薬による治療によりNASHの病理学的悪性度や肝細胞癌の発生が抑制されることが示されており44,45、SGLTの阻害が重篤なインスリン抵抗性を伴うNASH/肝細胞癌の抑制に有益である可能性が示唆されている。

糖尿病は様々な組織におけるインスリン作用の低下によって引き起こされるため、肝臓や他の組織におけるインスリン作用の低下は、STAMマウスや糖尿病・NASH患者におけるドライバー変異によって支持される発がんにつながる可能性がある。実際、PHZ治療とは異なり、インスリン治療はSTAMマウスの肝細胞癌を抑制した。肝臓では、インスリン治療はHIF-1αとその下流分子の減少に伴うワールブルグ効果を改善する。これは腫瘍増殖の抑制に寄与すると思われるが、腫瘍の発生を防ぐには十分ではないかもしれない。

最近の研究では、肝臓に体細胞突然変異を引き起こす化学物質で処理したマウスにHFDを与えると、ディスバイオシスの促進と有毒な二次胆汁酸の産生を介してHCCが誘発されることが示されている8。今回の研究でも、HFD摂食とSTZ注射によって、二次胆汁酸の変化に関連したdysbiosisが引き起こされることがわかった。したがって、dysbiosisがHCCの発症に原因的な役割を果たしている可能性があるが、このモデルにおいてどの細菌が役割を果たしているのか、正確にはまだわかっていない。糖尿病患者やNASH患者では、同様のタイプのディスバイオーシスが認められるが、インスリン治療を受けている患者では認められない。これらのデータから、腸におけるインスリンの作用が腸管バリア機能を制御し、HFDによって誘発されるディスバイオーシスとそれに続くHCCの発症を防いでいるという仮説を検証することになった。実際、インスリン治療はin vivoおよびin vitroで回腸におけるAMPの発現を有意に増加させた。さらに、腸管上皮細胞におけるインスリン受容体が破壊されたSTAMマウス（ieIRKOマウス）は、インスリン治療に抵抗性であり、ディスバイオージスを維持し、肝細胞癌の発症を抑制することが示された。さらに、ieIRKOマウスは長期的なHFD摂食で肝細胞癌が顕著に増加することから、肥満や不健康な食生活に伴う自然発生的な肝細胞癌の発症には、腸におけるインスリン抵抗性などのインスリンシグナルの障害が重要な役割を果たしていることが示唆される。これまでの研究で、DIOマウスの腸管上皮ではインスリン抵抗性が観察され29、ieIRKOマウスの腸管ではAMPの発現が低下していることが示されている13,46。したがって、糖尿病条件下では、腸管上皮細胞におけるインスリン作用が損なわれている可能性があり、NASHを合併した患者は肝細胞がんに罹患しやすい可能性がある。実際、今回の研究では、腸内のインスリン作用を補充することで、AMPの発現が回復し、腸内のインスリン受容体を介したディスバイオシスが改善することが明らかになった。

本研究では、B. massiliensisがこのモデルにおいて肝細胞癌を促進する役割を果たすかどうかは未解明のままである。確固とした結論を得るためには、単離と無菌マウスへの移植が必要であるが、この特定の細菌を単離することは極めて困難である。無菌マウスの脆弱性と、無菌分離器内でSTAMマウスを作製するためのポリ尿素や高脂肪食給餌に対する衛生管理は、克服すべき他の技術的問題である。ANCOMのような非バイアスの差分分析では、統計的に有意な菌種を決定することはできなかった。したがって、動物モデルを用いた更なる努力が必要であり、また、特定の生物種と肝細胞癌発症との直接的な関係を明らかにするためには、今後、NASHや糖尿病患者からの様々な検体や臨床データの収集も必要である。

結論として、マウスの糖尿病に伴う非アルコール性脂肪性肝炎や肝細胞癌の発症に対して、腸管のインスリンシグナルが保護的な役割を果たしており、糖尿病患者の腸管におけるインスリン作用の温存につながる治療は、NASHや肝細胞癌の予防に有用であると考えられる。

方法
マウス
動物実験手順は、国立国際医療研究センターの施設動物実験委員会（承認プロトコール番号：Med-P16-113、Med-P16-114）および東京大学の動物実験委員会（承認プロトコール番号：21077、2022-A044）の承認を得た。関連する倫理指針はすべて遵守した。

NASHモデルマウス（STAMTMマウス）は、以下のように以前に記載されたプロトコールに従って作製した16。STAMTMマウスは、2日齢の雄性C57B/6 Jマウス（日本CLEA、東京、日本）に低用量のストレプトゾトシン（STZ、200μg/頭）を皮下注射し、4週齢から高脂肪食32（日本CLEA、タンパク質25.5%、脂肪32.0%、無窒素抽出物29.4%、灰分4.0%、繊維2.9%、水6.2%からなる、HFD）を与えて作製した16。以前の研究で、STZとHFDを投与した雌マウスはNASHに基づく線維化を起こさず、肝細胞癌を発症しないことが明らかにされていたため、この研究で使用したマウスはすべて雄マウスであった16。

20週齢までインスリンまたはフロリジンを投与した実験（図2a）は、東京大学の依頼によりステリック総合研究所で行い、その他の実験は東京大学および国立国際医療研究センター研究所で行った。マウスの安楽死は、動物福祉の観点から、腫瘍の大きさに関係なく、重度の活動障害と体重の25％以上の減少を認めた時点で行った。

すべてのマウスは、12時間明期／12時間暗期サイクル、温度20～22℃、湿度40～60％のマクロ環境下で飼育され、滅菌水とペレットフードを自由に摂取できた。STAMTMマウスと食事誘発性肥満マウス以外は、特に指示がない限り、CE-2（CLEA Japan、東京、日本、タンパク質25.05%、脂肪4.77%、無窒素エキス49.82%、灰分7.04%、繊維4.44%、水8.88%）を与えた。

腸上皮特異的欠失モデルとして、Villin-Creマウス（The Jackson Laboratory, Bar Harbor, US）とインスリン受容体欠損マウス47、Akt1欠損マウス47、Akt2欠損マウス47、TSC2欠損マウス47を交配し、Villin-Creを作製した； IR-floxedマウス（ieIRKOマウス）、Villin-Cre；Akt1 Akt2-double-floxedマウス（ieAkt1/2DKOマウス）、Villin-Cre；Akt1 Akt2 TSC2-triple-floxedマウス（ieAkt1/2TSC2TKOマウス）を作製した。ジェノタイピングのためのプライマー配列は、本論文のSupplementary Data 1に示した。ieIRKOマウスは上記16と同様に処理してieIRKO-STAMマウスを作製した。ieAkt1/2DKOマウスおよびie Akt1/2TSC2TKOマウスを8週齢で使用し（補足図14）、HFD給餌でieIRKO-STAMマウスの表現型を20週齢および18ヶ月齢で観察した（図8）。

インスリンまたはフロリジン（PHZ）投与は、6週齢から1日2回（b.i.d.）皮下注射により実施した。注射には、インスリングラルギン（LANTUSTM、Sanofi Aventis）をクエン酸緩衝液（100 mM、pH 4.5）で希釈し、デグルデク（TRESIBATM、Novo Nordisc）を通常の生理食塩水で希釈したものを用いた。注射量は血糖値により決定し、12U/kgBW（20週齢試験用インスリングラルギン）、50U/kgBW（9週齢試験用インスリングラルギン）、12U/kgBW（20週齢試験用インスリングデグルデク）まで徐々に増加させた。PHZ（Sigma）は10％エタノール、15％DMSO、75％生理食塩水を含む溶液に溶解し、1日2回皮下注射（0.4g/kg）した。インスリン治療を行ったieIRKO-STAMマウスを用いた研究では、対照マウスには通常の生理食塩水を投与した。

これらの薬剤がこれらのモデルマウスの予後にどのような影響を及ぼすかを明らかにするために、長期および短期の試験を計画した。長期研究は、マウスが肝細胞癌が顕在化する段階、すなわち肝 "burn-out "段階に達する20週齢まで実施した。短期研究は、マウスが脂肪症と線維症を示し、関連遺伝子の発現レベルが上昇し、遺伝子プロファイリングの変化に対する治療効果を適切に解析できるようになる9週齢まで実施した。

9週齢では、インスリン投与により高血糖と高インスリン血症が改善されたが（図2g, h）、PHZ投与によりインスリン濃度は上昇せずに高血糖が同様に改善された（図2g, h）。これらの血糖値と血漿インスリンのパターンは、HCCが明らかになる20週齢まで、それぞれの治療群で維持された（補足図2a, b）。

抗生物質投与は、C57B/6 Jマウスを6週齢から20週齢まで、飲料水にアンピシリン1g/L（ナカライ）、ネオマイシン1g/L（WAKO）、バンコマイシン0.5g/L（WAKO）を添加して行った。

C57B/6 Jマウスに3種類の抗生物質を5日間投与した後、糞便微生物叢移植（FMT）を行った。最初の2週間は、抗生物質の投与を中止した直後から、新鮮な糞便懸濁液（0.1g/mL、600×g、1分間の遠心分離で得られた上清）を1日1回経口投与した。その後3週間は週3回経口投与した。それ以降は週1回の経口投与とした。FMTは6週齢から20週齢まで行った。

生体外初代組織培養では、8週齢のC57B/6 Jマウスを用いた。

胆汁酸ヒドロラーゼ(BSH)の阻害には、GR-7(Gut restricted -7、#HY-135747、Medchem express)をビヒクルとともに1日1回経口経口投与(20.8mg/kgBW)した。ビヒクルは10％DMSOと18％スルホブチルエーテル-β-シクロデキストリン（SBE-β-CD、#HY-17031、Medchem express）の通常生理食塩水からなる。GR-7は6週齢から20週齢までのマウスに投与した。対照群のマウスにはビヒクルを与えた。

患者
観察的横断研究のプロトコールはヘルシンキ宣言の倫理指針に従い、東京大学医科学研究センター倫理委員会の承認を得た（プロトコル番号3955、承認日2012年12月27日）。16Sメタゲノム解析は、2012年12月27日から2021年6月30日までの間に、東京大学医学部附属病院（日本、東京都千代田区）において、以下の基準に従って肝生検を経験した、または臨床的に重症の非B型非C型肝硬変と診断された成人患者27名から採取した便DNAサンプルに対して行った。肝硬変でない患者における肝生検の採用基準は、以前に共同研究者48によって記載されたものであり、この基準には患者がインスリン治療を受けているかどうかが含まれていないため、インスリン使用者と非使用者を比較する選択バイアスを最小限に抑えることができた。便サンプルは病室で直ちに凍結され、保冷剤とともに1日以内に研究室の冷凍庫に移された。検体はDNA抽出までマイナス80℃で保存された。全患者が書面によるインフォームド・コンセントを提供した。DMと診断されたことのない患者（6例）およびマッテオニ分類クラス2または1に分類された患者（1例）を除外した後、マッテオニ分類クラス4でNASHと診断された糖尿病患者または臨床的に肝硬変と診断された糖尿病患者20例を以下のように解析した。インスリン治療中であった5例の16 Sメタゲノミックデータを、残りの15例のデータと比較した。これらの患者の臨床的特徴を補足表4と5に示した。患者は、抗生物質、プロトンポンプ阻害薬、プロバイオティクス、その他の交絡因子の使用によって除外されなかった。我々は、試みた20検体すべての塩基配列を引き継いだ。サンプルサイズは先行研究31,49,50を参考にして決定した。また、EZR51ソフトウェア（バージョン4.2.2）により、動物実験（図4e）、標準偏差0.0918、投与有無の差0.154、統計的有意差（α）5％、検出力（1-β）80％、2群のサンプルサイズの比4から、サンプルサイズを2群それぞれ4と16と推定した。

組織採取
マウスを頚椎脱臼により安楽死させ、組織を迅速に取り出し、液体窒素で瞬時に凍結した。

遺伝子発現解析
組織トータルRNAミニキット（FAVORGEN）を用いてRNAを抽出した。KAPA SYBR Fast qPCR kit（KAPA BIOSYSTEMS）またはTaqmanプローブ（ABI）を用いてリアルタイム定量PCRを行った。発現量は18 S rRNA遺伝子の発現量に正規化した。プライマー配列は本論文の補足データ1に示されている。

全エクソーム配列解析
全エクソーム配列解析は、以前の報告52に従って、共同研究者の協力を得て行った。簡単に説明すると、新鮮凍結検体からDNAを抽出した。DNAとRNAはQiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kitを用いて抽出・精製した。SureSelect Mouse All Exon Kitを用いてエクソームキャプチャーを行い、HiSeq2500で塩基配列を決定した。配列データはkarkinos 4.1.11（マウスゲノムMGSCv37/mm9用に修正）で解析した。4mm以上の腫瘍は摘出し、DNA抽出に供した43。

DNAマイクロアレイ
STAMマウスの肝臓における特異的遺伝子発現パターンは、研究者の依頼により、タカラバイオ株式会社（日本、三重）のSurePrint G3 Mouse GE microarray 8 x 60Kを用いて、全肝RNAからAgilent Expression Array解析により調べた。Qiagen社製RNeasy Mini Kitを用いて、各群20週齢のSTAMマウス3匹のスナップ凍結肝臓サンプルから全RNAを抽出した。簡単に説明すると、メーカーの情報に従って、ターゲットサンプルをLow Input Quick Amp Labeling Kit, one-color (Agilent) を用いて調製した。Gene Expression Hybridization Kit（Agilent）でハイブリダイズし、Gene Expression Wash Buffers Pack（Agilent）で洗浄した。GO濃縮は、Metascape（バージョン3.0）とGO TRRUST（バージョン2）を用いて行った。STAMマウスの肝臓における関連シグナル伝達経路を探索するために、正常マウス、非処置対照STAMマウス、およびHCC期（20週齢）のインスリン投与STAMマウスの間で、マイクロアレイによる包括的な肝遺伝子発現解析を行った。

RNAシーケンス解析
マウス回腸全壁から抽出した全RNAをInvitrogen™ TURBO™ DNase（Invitrogen社）で処理し、研究者の依頼によりRhelixa, inc.がNovaSeq（Illumina社）を用いて全RNA塩基配列を決定した。FastqファイルはCLC genomics workbench (version 21.0.3, Qiagen)で解析し、マウスゲノムGRCm38 (mm10)を参照してアライメントを行った。GO濃縮はDAVID v6.8を用いて行った。高濃縮遺伝子は、STAMマウスのインスリン投与によって発現が上昇し（fold change, >1.5; FDR, P value < 0.05; read number, >4000）、インスリン投与STAMマウスの腸管上皮特異的インスリン受容体ノックアウト（ieIRKO）によって発現が低下した（fold change, <0.67; FDR, P value, <0.05; read number >4000、補足図11e）。

メタボローム解析
CE-TOF/MSおよびLC-TOF/MSシステムを用いた代謝物抽出と解析は、研究者の依頼により、過去の報告53,54,55に従ってHMT（Human Metabolome Technologies Inc. 各群3～4匹のSTAMマウスから、9週齢と20週齢の肝臓サンプルをスナップ凍結した。

CE-TOF/MS（n=3）では、凍結肝臓約40 mgを、内部標準物質を含む50%アセトニトリル/ミリQ水750 μLに0℃で浸漬し、酵素を不活化した。その後、組織をホモジナイズし、遠心分離した（2300×g、5分間）。その後、上層の水層を遠心ろ過してタンパク質を除去した。濾液を蒸発させて水に懸濁し、キャピラリー電気泳動質量分析（CE-MS）分析を行った。

陽イオン性化合物は Agilent CE TOFMS システム (Agilent Technologies) を用いたメタボローム解析のポジティブモードで測定し、陰イオン性化合物は Agilent CE および Agilent 6460 TripleQuad LC/MS システム (Agilent Technologies) を用いたメタボローム解析のポジティブモードおよびネガティブモードで測定しました。

LC-TOF/MS（n = 4、9 週齢用、n = 3、20 週齢用）では、約 45 mg の凍結肝臓を内部標準物質を含むアセトニトリル中 1%ギ酸に浸漬し、ホモジナイズした。溶解液を遠心分離し（200 x g、2 分間、3 回）、上清を保存した。ペレットを再度ホモジナイズし、167μLのMilli-Q水を加え、遠心分離した。上清を前者に加えた。その後、これらを遠心ろ過し、固相抽出法でリン脂質を除去した。ろ液を気化し、100μLの50％イソプロパノール（v/v）に懸濁し、LC-TOF/MSに用いた。

陽イオン性化合物は Agilent 1200 シリーズ RRLC システム SL (Agilent Technologies) を用いたメタボローム解析のポジティブモードで測定し、陰イオン性化合物は同システムのネガティブモードで測定した。

STAMマウスの肝臓では、メタボローム解析（液体クロマトグラフィー質量分析；LC/MS）により、98の候補分子のうち、13分子がSTAMモデルで発現上昇し（FC[STAM-NON/Normal]>2、n = 3）、インスリン投与により発現低下する（FC[STAM-INS/STAM-NON]<0. 5、n＝3）（図4a）。11種類の脂肪酸に加え、タウロヘノデオキシコール酸とタウロリトコール酸が含まれていた（図4b）。

メタボローム測定とPCoA解析は、Human Metabolome Technologies, Inc.のサービス施設で、それぞれMasterHands（図4a, bはバージョン2.16.0.15、補足図4d, 4e, 6a, 6bはバージョン2.17.1.11、補足図4f, 5は慶應義塾大学が開発）とSampleStat（バージョン3.14）を用いて行った。

16Sメタゲノム解析
QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (QIAGEN)を用いて抽出した糞便DNAを用いて16SリボソームRNAを解析した。ヒト16Sメタゲノム解析は、東京大学医学部附属病院糖尿病・代謝疾患内科で実施した。関連機器、装置、ベンチの滅菌は徹底して行った。

プライマー341 F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）および805 R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）を用いて、16 S rRNA遺伝子のV3およびV4超可変領域をターゲットに、Illumina 16 S Metagenomic Sequencing Library Preparationプロトコル（Illumina）に従って16 S rRNAシーケンスライブラリーを構築した。KAPA HiFi HotStart Ready Mix（KAPA）をPCRに用いた（95℃、3分；95℃30秒、55℃、30秒、72℃、30秒の25サイクル；72℃、5分；4℃保持）。イルミナアダプター付きプライマーの配列は、TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGとGTCTCGTGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGであった。これらのアンプリコンを用いてNextera XT Index Kit v2 Set A（イルミナ社）を用いてインデックスPCRを行い、16 S rRNAアンプリコンライブラリーを作製した。スパイクインPhiXコントロールの割合は20%であった。

MiSeqプラットフォームでのV3およびV4超可変領域の2×300bpペアエンドシーケンスには、各実験でIllumina MiSeq v3 Reagent Kitを使用した。DNA配列は、Miseq Control Software（MCS）およびBaseSpace Onsite 16 S Metagenomics App version 1.1.0（Illumina, Reference; Greengenes）を用いて処理した。ヒトの研究では、平均リード深度は67000リード、最小リード深度は24000リードであり、細菌の存在量は全リードに対するリードの割合で表された。一次成分分析は、Graphpad Prism 9.5.0を用いた。

STAMからFMTを行った実験の検証においてのみ、V4領域を増幅し、iSeq100システムを用いて2 x 150 bp paired-endで配列決定した。

Akkermansia muciniphila(AY271254), Bacteroides massiliensis(AY126616), Prevotellamassilia timonensis(NR144750.1), Acetatifactor muris(HM989805), Bacteroides acidifaciens(AB021164), Muribaculum intestinale(NR_144616. 1)を、Supplementary Fig.15cの基準で、Control-STAM-INSとControl-STAM-non-INSの比率が1以下であり、最大群平均が5％以上であるものを選択した。

ヒトマイクロバイオーム研究については、STORMS56（Strengthening The Organizing and Reporting of Microbiome Studies）チェックリストをSupplementary Data 2に、BaseSpace 16 S Metagenomics Appから作成したcsv形式の生物種数をSource Dataに示す。

生化学的アッセイ
タンパク質サンプルは標準肝バッファーを用いて得た。ウェスタンブロットは、Chemi-Lumi One L（ナカライ社製）またはChemi-Lumi One Super（ナカライ社製）を用いて行った。一次抗体として、Hif1a（1:1000、Novus、#NB100-105）、pHSL（1:1000、Cell Signaling Technology、#4139）、tHSL（1:1000、Cell Signaling Technology、CST#4107）、pS6（1:2000、Cell Signaling Technology、#5364）、tS6（1： 1000, Cell Signaling Technology, #2217 ）、pAkt（1:2000, Cell Signaling Technology, #4060 ）、およびtAkt（1:1000, Cell Signaling Technology, #4691 ）、βアクチン（1:12500, Sigma, #A4448 ）は上記のように希釈した57。二次HRP標識抗体（SantaCruz, #sc2357 ）は、抗マウスIgG（Jackson, #115 -035-062, 1:20000）を除き、1:5000で希釈した。定量的デンシトメトリー分析は、ImageJソフトウェア（バージョン1.52）のゲルアナライザーで行った。トリグリセリド、コレステロールおよびNEFAは、それぞれLabAssay™ TriglycerideおよびNEFA（富士フイルム、WAKO）を用いて測定した。インスリンは高感度インスリンELISAキット（森永製菓）を用いて測定した。血漿中AFPはMouse alpha-Fetoprotein/AFP Quantikine ELISA Kit（R＆D SYSTEMS）を用いて測定した。血漿中LPSはLPS ELISA Kit（CUSABIO）を用いて測定した。FD-4（Fluorescein isothiocyanate-dextran- 4 kDa）アッセイでは、マウスは経口摂取の4時間前から実験期間中絶食させた。4 kDa FITC-Dextran（40mg/mLをPBSに溶解し、20uL/gBWを投与）を経口投与した。4時間後（飲水、摂食なし）、マウスから血漿を採取し、Excitation： 励起波長：490 nm、発光波長：530 nmにおける蛍光強度を測定した。

組織学的分析
20週齢までインスリンまたはPHZを投与したマウスの組織学的検査（図2a）は、肝臓サンプルをOCT化合物で固定し、その他の実験では肝臓サンプルを4％緩衝ホルマリンで一晩固定し、パラフィンに包埋した。全サンプルを5μmの厚さで切 り取り、ヘマトキシリン・エオジンで染色した。非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）活性は、NAFLD活性スコアで評価した。以下は、半定量的に評価した：脂肪症（0-3点）、小葉の炎症（0-2点）、肝細胞のバルーン化（0-2点）、および線維症（0-4点）58。線維症解析のため、肝臓サンプルもシリウスレッドで染色した。20週齢までインスリンまたはPHZを投与した実験（図2a）では、Stelic Institute & Co.社の研究者の依頼により、マウス1匹につき3枚の画像についてImage J（バージョン1.52）を用いてシリウスレッド陽性面積の割合を測定した。腸管サンプルはPAS-アルシアンブルー染色でも染色した。

初代組織培養
以前の報告37を参考に、8週齢のマウスの回腸組織をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、1cmの長さに切断して開腹し、24ウェルプレートに入れ、5％FBS、7.5％ゼラチン、D(+)-グルコース（最終濃度200mM）、抗生物質を添加したRPMI1640中で保存した。その後、組織を100 nMのヒト組換えインスリン（Humarin R、Eli Lilly社製）と共に37℃、5% CO2で培養した。

定量化と統計解析
データは平均値±SEMで示した。複製数は図の凡例でNとして表されており、これは示されたin vivoでの研究に利用可能なマウスの数を表している。統計解析はGraph Pad Prism 9.5.0ソフトウェアを用いて行った。2群間の差は、対応のない両側t検定またはMann-WhitneyのU検定を用いて有意性を評価した。一元配置分散分析（One-way ANOVA）および多重比較は、図の説明に従って行った。統計的に有意な値はP < 0.05であった。サンプルサイズの推定はEZ-Rソフトウェア（Version 4.2.2、RcmdrのVersionは2.8-0.51）で行った。

報告概要
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。

データの利用可能性
本研究で得られたマウスの全エクソームシーケンスデータおよびメタゲノムデータは、アクセッションコードPRJNA866345でSRAデータベースに寄託されている。本研究で得られたマウスの回腸のRNAシーケンスデータはGEOデータベースにアクセッションコードGSE210876で登録されている。本研究で得られたマウス肝臓のマイクロアレイデータは、アクセッションコードGSE210517でGEOデータベースに寄託されている。本研究で作成したヒトメタゲノミックデータは、DDBJデータベースにstudy accession code JGAS000574およびdataset code JGAD000700で寄託されている[https://humandbs.biosciencedbc.jp/en/hum0371-v1]。DDBJに登録されているデータを入手するためには、個人情報保護法に基づく「人を対象とする生命科学・医学系研究に関する倫理指針」に従い、NBDCヒトデータ利用申請書を提出し、アクセス制御されたデータを入手する必要がある。アクセス方法は以下のURL; https://humandbs.biosciencedbc.jp/en/data-use。出典データは本論文に添付されている。マウスゲノム MGSCv37/mm9（Whole exome sequencing用）、GRCm38/mm10（RNA sequencing用）、Greengenes（16 S metagenomics用）を参考にした。ソースデータは本論文に添付されている。

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謝辞
本研究は、日本医療研究開発機構肝炎研究プログラム(JP17fk0210304, JP18fk0210040, JP19fk0210040, JP20fk0210040, JP21fk0210090 to K.U.)、科学研究費補助金(21659227, to K.U.)の助成を受けた。Akt1 floxedマウスおよびAkt2 floxedマウスをそれぞれ提供してくださったC. Ronald Kan博士（Joslin Diabetes Center）およびMorris Birnbaum博士（Pfizer）、動物飼育の技術的な支援をしてくださった高橋文哉氏、正木裕子氏、佐久間靖子氏、本間玲子氏、帖佐瑞紀氏、太田靖子氏、優れた秘書業務をしてくださった松田みのり氏に感謝する。形態顕微鏡観察にご協力いただいた田村中野美和氏、大山千夏氏（国立国際医療研究センター共同研究室）に感謝する。また、ex vivo ielum実験について助言をいただいた川村由紀先生（国立国際医療研究センター研究所消化器内科）に感謝する。

著者情報
著者および所属
国立国際医療研究センター研究所 糖尿病研究センター 分子糖尿病内科

添田耕太郎、笹子貴義、小林直樹、松本生島佳子、粟澤基晴、戸田剛太郎、植木耕二郎

東京大学大学院医学系研究科糖尿病・代謝疾患学分野

添田耕太郎、笹子隆義、久保田直人、戸田剛太郎、山内敏正、門脇孝史

東京大学消化器内科、日本、東京

榎健一郎、山田智晴、中塚拓馬、立石亮介、藤代光弘、小池和彦

国立国際医療研究センター研究所糖尿病研究センター糖尿病・代謝情報センター（日本、東京

坊内 良太郎

東京大学ゲノム科学総合研究センター、東京

垣内美和子、山本省吾、辰野健二、油谷博之

慶應義塾大学医学部微生物・免疫学教室（日本、東京

アタラシ浩二・本田賢也

理化学研究所 統合生命医科学研究センター 神奈川県横浜市

アタラシ浩二、須田渉、本田賢也

財団法人がん研究会がん研究所細胞生物学分野、東京

野田哲夫

東京大学大学院医学系研究科糖尿病・生活習慣病予防学分野

門脇孝

虎の門病院

門脇 隆

東京大学大学院医学系研究科 分子糖尿病学分野

植木 孝次郎

寄稿
K.S.およびK.U.が研究を計画し、原稿を執筆した。K.S.およびK.U.が実験の大部分を実施し、解析した。K.E.、T.Y. Yamada.、T.Nakatsuka.、R.T. M.F.およびK.K.がNASH疑い患者の肝生検を実施した、 K.H.、K.A.、W.S.はメタゲノム解析に協力し、T.S.、N.Kobayashi、Y.I.、M.A.、R.B.、G.T.、N.Kubota、T.Noda.、T.Yamauchi Y.I.は実験に協力し、K.U.は研究資金を獲得し、門脇毅は研究を監督した。

責任著者
植木耕二郎宛。

倫理申告
競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。

査読
査読情報
Nature Communicationsは、本論文の査読に貢献した匿名査読者に感謝する。査読ファイルはこちら。

追加情報
出版社からの注記 Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

補足情報
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ソースデータ
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権利と許可
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この記事の引用
非アルコール性脂肪性肝炎を合併した糖尿病マウスにおいて、腸管インスリン作用が肝発癌を予防する. Nat Commun 14, 6584 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-42334-y

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受領
2021年10月12日

受理
2023年10月05日

発行
2023年10月18日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41467-023-42334-y

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ネイチャー・コミュニケーションズ（Nat Commun） ISSN 2041-1723（オンライン）

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