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オリジナル研究論文
Front. 微生物学、2024年01月05日
第2章 脊椎動物の消化器系における微生物
第14巻-2023年｜https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1241309
糞便微生物叢移植は腸管透過性を修復し、5-HTの発現を制御してC57BL/6Jマウスのアルコール誘発性うつ様行動に影響を及ぼす。
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2023.1241309/full



Dezhi Li1 Wei Liang2 Wentong Zhang1 Zhiqiang Huang1 Haipeng Liang3* Qing Liu1*
1上海科技大学健康科学工程学院（中国、上海市
2広西医科大学第四附属病院、柳州、中国
3青陽市人民病院外科、青陽、中国
アルコール乱用の流行は、世界中で何百万人もの人々に影響を及ぼしている。腸内細菌叢（GM）が中枢神経系（CNS）の機能に重要な役割を果たしており、その組成はアルコール摂取後に変化するという考え方が、関連する証拠によって支持されている。そこで本研究の目的は、糞便微生物叢移植（FMT）による腸内細菌叢の再構築がアルコール依存症に及ぼす影響を検討することであった。ここでは、C57BL/6Jマウスを用いてアルコール依存症モデルを構築し、FMT投与によりアルコール依存症マウスの不安様行動およびアルコール探索行動が改善することを証明した。さらに、FMT後に腸管細胞間タイトジャンクション構造タンパク質ZO-1およびオクルジンの発現が有意に増加することを見出した。FMTはアルコール依存性マウスの腸管透過性を修復し、リポ多糖（LPS）と炎症性因子のレベルを低下させた。さらに、セロトニン（5-ヒドロキシトリプタミン、5-HT）含量は、健常マウスの糞便マイクロバイオーム投与後、アルコール依存性マウスの腸および脳組織で有意に増加した。16S rRNA配列決定により、FMTは腸内細菌叢の組成を著しく変化させ、腸管バリアと5-HT量に変化をもたらすことが示された。これらの結果を総合すると、FMTはアルコール依存症の緩和効果を有することが明らかになり、その基礎となるメカニズムが探求された。

はじめに
アルコールは世界で最も一般的な依存性物質の一つである（Carbiaら、2021年）。長期飲酒はアルコールに対する心理的・生理的依存を引き起こし、アルコール依存症を形成する（Gorini et al.） 慢性再発性精神疾患であるアルコール依存症は、アルコールを求め、飲酒をコントロールできなくなることが特徴である（Dina et al.、2006）。さらに、アルコール依存症では抑うつ、不安、不眠などの一連の離脱症状が現れることがある（Retsonら、2015；Hendricksら、2017）。アルコール依存症の発症には、環境因子、心理社会的因子、神経生物学的因子、遺伝的因子が関連していることが証明されている（Arya et al.） しかし、アルコール中毒の根底にある分子メカニズムはまだ完全には解明されていない。さらに重要なことは、既存のアルコール依存症の発症メカニズムに基づく治療が患者にとって有効でないことであり、この問題を解決する新たな戦略が早急に必要とされている（Rathinam and Ezhumalai, 2022）。

近年、腸内細菌叢の役割が注目されている。腸内細菌叢は、様々な経路を通じて中枢神経系に影響を与え、神経精神疾患の発症に関与する可能性がある（Agirman et al.、2021）。最近の研究では、アルコール曝露がマウス、ラット、ヒトの腸内細菌叢の組成を変化させることが明らかになったが（Wang et al., 2018; Kosnicki et al., 2019; Carbia et al., 2023）、これらの研究のほとんどは消化器系への影響に焦点を当てており、神経系への影響は無視されている。

神経系疾患を研究する分野では、腸脳軸がますます注目を集めている。多くの研究が、アルコール暴露が腸内細菌叢の変化を引き起こすことを示しており（Robinson et al.、2014）、いくつかのプロバイオティクスサプリメントは、アルコールに関連した肝臓や腸の損傷を緩和することが判明している（Yao et al.、2022）。ある研究ではさらに踏み込んで、アルコール依存マウスから健常マウスへの胎児微生物叢の移入が、アルコール離脱誘発性不安行動をもたらすことを発見した。そのメカニズムは、FMTが脳神経伝達物質の合成に影響を与えることかもしれないが、具体的なメカニズムは解明されていない（Xiao et al.） 実際、GMはうつ病と表裏一体の関係にあり、物質依存の原因のひとつと考えられている（Kaelberer et al., 2018; Angoa-Perez and Kuhn, 2021）。しかし、短鎖脂肪酸産生、トリプトファン代謝とサイトカイン発現調節、免疫活性化は、脳と微生物の相互作用の潜在的な経路である（Carbia et al.） 無菌マウスでは、不安様行動の減少とセロトニン受容体の発現低下が観察された（Wichers and Maes, 2004）。主要な神経伝達物質である5-ヒドロキシトリプタミン（5-HT）は、オピオイドペプチド、γ-アミノ酪酸、グルタミン酸、その他の伝達物質の分泌を調節することができ、情動、認知、物質依存などの多くの側面において重要な調節的役割を担っている（Li et al.） 体内の5-HTの95％以上は腸神経系（ENS）で産生され（Mayer, 2011）、腸球菌など一部の細菌種は5-HTを産生する（Clarke et al.） もう一つの重要な点は、アルコールが腸上皮層に直接ダメージを与えることである。その後、LPSなどの腸内細菌産物が血流に入り、炎症反応を引き起こし、最終的には脳神経の異常活動につながる（Blednov et al.） それによると、腸内細菌叢はアルコール依存症治療の新たなターゲットになるかもしれない（Leclercq et al.） しかし、うつ病などのアルコール離脱症状に対するFMTの効果を確認するエビデンスは今のところ不十分である。

本研究では、アルコール誘発性うつ症状に対するFMTの改善効果をマウスで探索することを目的とした。さらに、全身の炎症反応と5-HT経路に起因する脳-腸機能障害に対するFMTの機能的メカニズムの解明を行い、抗アルコール性うつ病薬としての可能性を探ることを目的とした。

材料と方法
動物
本研究では、体重18～22gの6週齢の雄性C57BL/6Jマウスを傑傑（中国、上海）から入手した。すべてのマウスは、室温21℃、12時間の明暗サイクル下で飼育された。動物実験は中国倫理委員会の承認を得て、倫理基準に従って実施した。

アルコール中毒モデルの確立
6～8週齢の雄性C57BL/6マウス25匹に、水溶液とアルコール溶液を二重瓶に入れて与えた。アルコール溶液の濃度は3%、6%、10%(v/v)とし、4日ごとにアルコール濃度勾配を増加させ、マウスのアルコール適応能力を訓練した。8日後、アルコール溶液の濃度を10％に上げ、さらに16日間給餌を続けた。中毒サイクル終了後、アルコール溶液を24時間、すなわちアルコール離脱させた。対照群のマウス5匹は水溶液を飲ませ、その他の条件は実験群と同じにした。位置選好を避けるため、水ボトルの位置を毎日変える。

ドナー便の調製と投与
ドナーマウス（対照群、n＝5）を滅菌採便箱に入れ、排便直後に滅菌鉗子を用いて糞便を滅菌遠沈管に採取し、4℃のアイスボックスに入れた。ドナーの糞便を秤量し、滅菌PBSに15分間浸漬した。糞便をオシレーターで十分に振とうして懸濁液とし、800 r/分で5分間、4℃で遠心分離した。

オープンフィールド試験
オープンフィールド試験(OFT)は、マウスの不安様行動と運動活性を測定するために一般的に用いられている(Resmimら、2023)。オープンフィールドに対する恐怖のため、マウスは中心部ではあまり動かず、主に周辺部で動く。しかし、マウスの探索特性は中心領域での移動の動機づけにつながる。中心部での移動時間と移動距離の減少は、マウスの不安の増大を示していることが観察できる。マウスをオープンエリア（50cm×50cm×40cm、縦×横×高さ）に1分間置き、環境に慣らした後、5分間自由に探索させた。オープンフィールドチャンバーの中央上部にビデオカメラを設置し、自動ビデオトラッキングシステムにより各マウスの動きを記録し、動物行動ビデオ解析システムにより中央部での移動距離と時間、総移動距離、速度などに変換し、従属変数とした。試験中、75%エタノールを用いて新しいマウスごとにオープンフィールドを清掃し、残留臭気情報が次のマウスの結果に影響を与えないようにした。各マウスは3回テストされ、移動時間と移動距離は平均された。

明暗遷移試験
明暗移行試験(LDT)もマウスの不安様行動を測定する行動試験である(Rosa-Goncalvesら、2022)。明暗室の2辺は等しい大きさの区画（20cm×20cm×25cm、縦×横×高さ）で、半分が明、もう半分が暗となっており、真ん中はマウスが自由に歩けるように小さな穴でつながっていた。げっ歯類は暗くなって新しい環境を自発的に探索する性質があり、マウスの探索的な性格がオープンボックス活動を試みさせる。しかし、不安なマウスは明るい光刺激に反応してすぐに暗室に移動し、暗室から出ることはほとんどなかった。したがって、暗箱にいる時間の増加は不安の増加を示し、マウスの不安を観察するのに利用できる。実験中、マウスは開放箱に入れられ、1分間環境に慣らした後、5分間自由に探索した。明暗ボックスの上部にビデオシステムを設置し、明暗ボックス内でのマウスの滞留時間と活動を自動ビデオ追跡システムで観察・記録した。試験中、75%エタノールを用いて新しいマウスごとにオープンフィールドを洗浄し、残留臭気情報が次のマウスの結果に影響しないようにした。各マウスは3回テストを行い、暗箱内で過ごした時間を平均した。

酵素結合免疫吸着アッセイ
製造元の指示（Elabscience, Wuhan, China）に従い、5-HT、LPS、FABP2、TNF-α、IL-4およびIL-18の濃度をELISAアッセイにより測定した。酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）プレートに、各試料の3倍量（100μL）を添加した。作業曲線は参照標準を用いて確立し、反応試薬は説明書に従って順次添加した。炎症性サイトカインレベルは、マイクロプレートリーダーでの450nmの吸光度測定により決定した。アッセイは、3つの独立した実験を3連で行った。

免疫組織化学
マウスをペントバルビタールナトリウム（40 mg/kg、i.p.）で深麻酔し、0.1 M PBS（pH7.4、37℃）で灌流した後、0.1 M PBS中の4％（w/v）パラホルムアルデヒドで固定した。結腸と脳の組織サンプルは、結晶ミクロトーム（Leica RM 2135, Wetzlar, Germany）を用いて5 μmの切片にスライスし、前述のようにキシレン脱脂と勾配エタノール水和を行った。スライド上の組織を0.1Mトリス緩衝食塩水で10分間平衡化し、10%ヤギ血清で1時間ブロックした。その後、海馬の組織を抗5HT1A（1:100, ab85615, abcam）または抗5HT2A（1:100, ab66049, abcam）を含む一次抗体で1時間インキュベートし、結腸の組織をそれぞれ抗ZO-1（1:100, ab216880, abcam）または抗occludin（1:100, ab216327, abcam）の一次抗体で1時間インキュベートした。一次抗体インキュベーション後、スライドをPBSで十分に洗浄し、続いて二次抗体インキュベーションを行った。最後に、スライドをグリセリンベースのマウンティングメディアでマウントし、蛍光顕微鏡で観察した。

RNA単離とqRT-PCR
Trizol（Invitrogen, Carlsbad, CA, United States）を用いてマウス組織から全RNAを抽出した。cDNAは、HiScript II QRT Supermix（Vazyme Biotech社製）を用いて、メーカーのプロトコールに従って作製した。mRNAの転写レベルは、One Step qRT-PCR SYBR Green kit（Vazyme Biotech）の説明書に従って測定した。内部コントロールとしてβ-Actin遺伝子を選択し、mRNA相対発現レベルの算出には2-ΔΔCt法を用いた。有意性を決定するために、独立して4回の反復を行った。使用したプライマーを表1に示す。

表1
www.frontiersin.org
表1. 本研究で使用したプライマー。

16S rRNA遺伝子の塩基配列決定
E.Z.N.A Stool DNA kit（Omega Bio-tek, Norcross, GA, United States）の説明書に従い、便から微生物DNAを抽出した。次に、抽出したDNAの純度と濃度をNanoDrop 2000分光光度計で測定し、抽出したDNAの質を1％アガロースゲル電気泳動で測定した。16S rDNA遺伝子のV3-V4領域を選択し、338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）および806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTA-3′）プライマーを用いてPCRを行った。増幅されたPCR断片は、シーケンスライブラリーを作成するために、Agencourt AMPure XPビーズを用いて精製した。シーケンシングはIllumina MiSeqプラットフォームで、リード長300bp、40% phiX quality controlのペアエンド(PE)法で行った。シーケンスデータはGenBank short-read archive (SRA)にアクセッション番号で登録されている： PRJNA720241。

生データ処理パイプライン
Trimmomatic19 v0.39を使用して、"TRAILING:20"、"SLIDINGWINDOW:50:20"、"MINLEN:50 "のパラメータで低品質リードをフィルターした。品質管理後、FLASH20 v1.2.9を使用して、オーバーラップ長を最小10bp、オーバーラップ領域の許容ミスマッチ密度を0.2としてペアリードをマージした。その後、USEARCH21 v11.0.667を使用し、類似度閾値0.97のUPARSEでアライメントしたリードをクラスタリングした。OUT代表配列の分類学的割り当てには、QIIME22 v1.9を参照データベースSILVA 12823を用いたRDP法で用い、この解析アプローチから得られた結果の精度と信頼性を高めるためにブートストラップ値を0.7に設定した。結果として得られた表には、OUTの存在量と分類学的分類データの両方に関する情報が含まれていた。

微生物多様性解析と統計量の比較
アルファ多様性はMothur24 v1.4を用いて希薄化OUT表から計算した。生物多様性のシャノン指標は、OTU の存在量に基づいて評価した。主座標分析はMicrobiomeAnalyst25を用いて行った。

統計解析
本研究で得られたデータは、GraphPad Prism 8を用いて解析した。データは平均値±SEMで示し、各群のサンプル数（n）を付記した。ヒストグラムおよびKolmogorov-Smirnov分析の結果、得られたデータは正規分布に一致した。2群間の比較には、統計的有意性を分析するために、対応のないt検定を用いた。2群以上の比較には、一元配置分散分析（ANOVA）を用い、Tukeyのt検定を行った。p値が0.05未満の結果を統計的に有意とみなした。

結果
体重と1日のアルコール摂取量
アルコール依存症患者は、アルコール離脱後の離脱症状に加えて、アルコール摂取量が徐々に増加し、強いアルコール依存症になるなどの臨床症状も示す。C57BL/6マウスに水溶液とアルコール溶液を2本ずつ供給してアルコール中毒モデルを構築した後、アルコール群と対照群のマウスの体重とアルコール嗜好比を比較した。アルコール嗜好性比は、マウスが同時に摂取した水溶液とアルコール溶液の総重量に対するアルコール溶液の重量の割合（百分率）として算出し、この結果を用いてマウスのアルコール嗜好性の程度を比較した。図1Aからわかるように、0日目から12日目まで、アルコール溶液の濃度が3％から6％へ、そして10％へと増加すると、マウスのアルコール溶液の摂取量は徐々に増加し、アルコール嗜好率は53％から68％へ、そして88％へと増加した。12日目以降、アルコール溶液濃度は10％を維持し、飲酒マウス全体のアルコール嗜好率も70％以上を維持した。飲酒期間中のマウスの体重変化を図1Bに示した。飲酒群のマウスの体重増加は対照群に比べ6.8％減少した。飲酒24日目には、両群のマウスの体重変化は有意に異なっていた（p < 0.05）。

図1
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図1 （A）水に対するアルコール溶液摂取のラジオ。アルコール溶液の濃度は3, 6, 10%(v/v)とし、マウスのアルコール適応能力を訓練するために4日ごとにアルコールの濃度勾配を増加させた。8日後、アルコール溶液の濃度を10%に上げ、さらに16日間給餌を続けた。各データ点は、そのケージにおけるアルコール消費量と水消費量の比率を表す（n = 8）。(B）24日間給餌中の2群の体重。対照群（n = 5）、アルコール群（n = 25） *p < 0.05。

離脱マウスは不安と抑うつを行った
OFTの結果、アルコール離脱群の平均運動時間（13.5秒）は、アルコール群（15.6秒）および対照群（20.0秒）よりも短かった（図2A）。アルコール離脱群のマウスの中心領域の平均移動距離（304.0mm）は、アルコール群（367.6mm）および対照群（388.2mm）よりも短かった（図2B）。また、アルコール離脱群（5.3％）では、アルコール群（6.7％）および対照群（8.2％）に比べて、総移動距離に対する中心領域の移動距離の割合が低かった（図2D）。これらの3つのデータから、BALB/cマウスはアルコール離脱後、中枢領域の探索活動が低下し、不安で抑うつ的な気分になることが示唆された。しかし、コントロールマウスや離脱前マウスと比較して、統計的に有意な差は見られなかった。総移動距離と平均移動速度を用いて、オープンフィールドボックスにおけるマウスの自律行動を解析したところ、コントロール群では図2C,Eに示すようになった（p < 0.05）。断薬後、マウスの随意行動活性は増加した。LDT解析によると、図2Fに示すように、アルコール離脱群、アルコール群、対照群の暗箱内での平均滞留時間は、それぞれ213.4秒、189.4秒、171.5秒であった。アルコール離脱後、マウスは暗箱にいる時間が長くなり、飲酒群のマウスは対照群よりも暗箱にいる時間がわずかに長くなった。飲酒群のマウスは飲酒中に不安と抑うつを示し、その傾向はアルコール離脱後に増加した。

図2
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図2. 行動試験。(A) 中心ゾーンでの滞在時間。(B）中央ゾーンでの移動距離。(C）総移動距離。(D）中央ゾーンでの移動距離／合計（％）。(E）平均速度。(F）ダークボックス内の時間速度。対照群（n = 5）、アルコール群（n = 25）、アルコール離脱群（n = 25）。

アルコール依存症群における微生物叢組成の変化
図3Aの3群の希釈曲線は、解析塩基配列数の増加とともに平坦になる傾向があり、このことは、今回の解析データ量が妥当であり、サンプル中の細菌をほぼ網羅していることを示しており、このまま解析量を増やしても新種はほとんど出現しないと考えられる。

図3
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図3. アルコールの過剰摂取が腸内細菌叢の構成に与える影響。(A）希釈曲線。横座標は無作為に選択したシーケンスデータの量、縦座標は観察された種の豊富さ指数。(B）サンプルのOTUレベルでの主成分分析（PCA）。3グループの糞便微生物群は、その群集組成に基づき、明確なクラスタリングパターンを示した。(C）ACE多様性指数。(D）シャノン多様性指数。(E,F）コントロール群（n = 5）、アルコール0d群（n = 25）、アルコール24d群（n = 25）。16S配列決定により、門レベル、属レベルおよびマウスにおける腸内細菌パターンの変化を評価した。横座標はサンプル名、縦座標はサンプル中の種の割合、列の異なる色は異なる種を表し、列の長さは種の相対的存在量を表す。

図中、Alcohol_24d群はコントロール群に近く、Alcohol_0d群からは離れており、これら3群はPC1軸とPC2軸上で分離することができた（図3B）。また、他の条件の影響を除き、アルコール摂取後にマウスのGMの種組成と存在量が変化することが示された。

図3C,Dはα多様性指標ACEとShannonの比較である。ACE指数は、アルコール_0d群と比較して、アルコール_24d群および対照群のGM種の豊かさが有意に増加したことを示し、対照群のGM種の豊かさはアルコール_24d群よりも有意に高かった（p < 0.01）。種多様性をシャノン指数で評価したところ、アルコール0d群と比較して、アルコール24d群と対照群ではGM種多様性が有意に増加し、対照群はアルコール24d群よりも種多様性がわずかに高かった。このことから、アルコール摂取はマウスのGM種の豊かさと多様性の減少につながることが示唆された。

サンプルの種の豊富さと群集組成を、異なる分類学的レベルで分析した。アルコール依存マウスと健常マウスの腸内細菌叢の違いを分類群レベルで解析したところ（図3E）、3群における優勢菌の上位2つはバクテロイデーテス（Bacteroidetes）とファーミキューテス（Firmicutes）であり、その割合は3群間で異なっていた。種の相対量では、アルコール_0d群では放線菌とプロテオバクテリアが次いで多く、アルコール_24d群と対照群ではパテシバクテリアとプロテオバクテリアが3位と4位であった。属レベルでは（図3F）、3群ともnorank_f_MuribaculaceaeとLactobacillusが1位と2位を占め、Alcohol_24d群ではLactobacillusの存在量が減少した。種の相対量によると、StreptococcusとSaccharimonasはアルコール0d群で多く、TuricibacterとCandidatus_saccharimonasはアルコール24d群で多かった。対照群ではTuricibacter属とPrevotellaceae_UCG_001属の割合が高かった。Alcohol_24d群では、Alcohol_0d群および対照群と比較して、群集組成および種濃度に変化がみられた。

健康マウスの糞便微生物叢を移植するとアルコール依存症マウスの腸内細菌叢の組成が回復する
ACE指標で種の豊富さを評価したところ、AL_FMT群の豊富さはAL_PBS群よりも高かった。アルコール群と比較して、AL_FMT群のマウスのGM種の豊かさは有意に増加した（p < 0.001）（図4A）。シャノン指数によると、アルコール群、AL_FMT群、AL_PBS群のマウスのGM種の多様性に有意差はなかった（図4B）。これらの結果から、飲酒マウスへのFMTはマウスのGM種の豊かさを増加させるが、種の多様性に有意な変化はないことが示された。AL_FMTマウスと健常マウスの腸内細菌叢の違いを解析したところ、門レベル（図4C）では、AL_FMTマウスではVerrucomicrobiaの存在量が増加し、Epsilonbacteraeotaの存在量は減少した。属レベルでは（図4D,F）、AL_FMT群では2属（Ruminococcaceae UCG-014およびAkkermansia）の含量が有意に増加し、Helicobacter、Odoribacter、LachnospiraceaeおよびAlistipesの含量は有意に減少した。AL_FMT群とアルコール群の菌種構成はPCAで明確に分離できたが、AL_PBS群はアルコール群と類似していた（図4E）。このことは、FMTがアルコール依存性マウスのGM組成と存在量を変化させる可能性を示している。

図4
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図4. アルコール依存症マウスの腸内細菌叢に対する糞便細菌移植の再形成効果。(A）ACE多様性指数。(B）シャノン多様性指数。(C,D)16S配列決定により、門レベル、属レベルおよびマウスにおける腸内細菌パターンの変化を評価した。アルコール群（n = 25）、AL_FMT群（n = 17）、AL_PBS群（n = 6）。横座標はサンプル名、縦座標はサンプル中の種の割合、列の異なる色は異なる種を表し、列の長さは種の相対的存在量を表す。(E）OTUレベルでのサンプルの主成分分析（PCA）。(F)属レベルでの異なる種の有意性を示すスチューデントt検定。*p < 0.05.

FMTはアルコール誘発行動障害を改善した
FMTを14日間行った後、アルコール依存マウスをアルコール離脱前と離脱後に行動検査を行った。行動検査は、健常ドナーからFMTを受けたアルコール依存マウス（AL_FMT群）で行い、行動検査はアルコール離脱24時間後のAL_FMTマウス（AL_FMT_Withdrawal群）で行った。AL_PBS群で行動検査を行った。AL_PBS群でアルコール離脱24時間後に行動検査を行った（AL_PBS_Withdrawal群）。OFTおよびLDTの運動軌跡を図5A,Bに示すが、対照群と比較して、アルコール群マウスはアルコール離脱24時間後にオープンフィールドおよび暗箱内を好んで移動し、対照マウスからマイクロバイオームを摂取すると抑うつ様行動が改善した。アルコール群とアルコール離脱を行わない対照群では、マウスの行動に有意差は見られなかった。

図5
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図5 （A）OFTにおける代表的な動物の軌跡。中心部は青い四角で囲まれている。(B）LDTにおける代表的な動物の軌跡。

FMTはアルコール依存性マウスの腸および脳組織における5-HT含量を増加させ、5-HT受容体の発現を促進した。
主要な神経伝達物質である5-ヒドロキシトリプタミン（5-HT）は、オピオイドペプチド、γ-アミノ酪酸、グルタミン酸およびその他の伝達物質の分泌を調節することができ、感情、認知、物質依存などの多くの側面において重要な調節的役割を担っている。さらに注目すべきは、5-HTの95％が腸神経系で産生されていることである。そこで、FMTが5-HT含量に及ぼす影響を調べたところ、健常マウスの糞便マイクロバイオームを投与したアルコール依存症マウスの腸組織および脳組織において、5-HT含量が有意に増加することが示された（図6A,B）。一部の5-HT受容体の機能異常も物質依存の原因であることを考慮し、それに関連する受容体（5-HT1A、5-HT2A、5-HT1B、5-HT3、5-HT6）を調べた。図6Dに示すように、アルコール依存マウスでは5-HT1Aと5-HT2A受容体の発現が低下していたが、FMTは5-HT1Aと5-HT2AのmRNA発現レベルを有意に増加させた。さらに、免疫組織化学的アッセイによって海馬における5-HT受容体の存在を調べたところ、qPCRの結果と一致した（図6C）。このことから、FMTは5-HTとその受容体である5-HT1Aおよび5-HT2Aを増加させることにより、おそらくアルコール離脱症候群を緩和する可能性があることが示された。

図6
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図6 （A）脳内5-HT濃度。(B）腸組織における5-HTの濃度。(C）各群の海馬切片の5-HT1Aと5-HT2Aを免疫組織化学的に染色した。スケールバー＝50μm。(D）物質依存に関連する5-HT受容体に関連する遺伝子の定量化。対照群（n = 5）、アルコール群（n = 25）およびAL_FMT群（n = 17）。マウス海馬の異なるグループにおける5-HT1A、5-HT2A、5-HT1B、5-HT3および5-HT6の発現レベルをqRT-PCRにより測定した。得られたサイクル閾値（CT）はβ-アクチンのCTに対して正規化した。データは3回の独立した実験の平均値±SDで示され、各実験は4回の個別測定で構成されている。有意差については、対応のないt検定を行った。*p < 0.05および**p < 0.01。

FMTはタイトジャンクションタンパク質ZO-1とオクルディンの発現を促進する
アルコールの代謝産物は、腸内のタイトジャンクションタンパク質の破壊につながる可能性がある。蛍光定量PCR法の結果から、健常マウスと比較して、アルコール依存性マウスの腸におけるZO-1とオクルディンのmRNA転写レベルはそれぞれ3-4倍低下しており、FMT処理後、ZO-1とオクルディンの転写レベルは健常レベルまで回復した（図7B）。TJの構造的完全性をさらに確認するために、免疫蛍光法を用いて大腸におけるZO-1とオクルディンのタンパク質発現レベルを検出した。その結果、アルコール依存マウスではZO-1とオクルディンの発現レベルが有意に低下していることが示されたが、FMTはこの2つのタンパク質の変化を改善することができた（図7A）。

図7
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図7 （A）結腸組織におけるタイトジャンクション関連タンパク質ZO-1（緑色蛍光）とオクルディン（赤色蛍光）の免疫蛍光検出。核は青色蛍光を発するDAPIで対比染色した。スケールバー＝50μm。(B）ZO-1とオクルディンの発現レベルをqRT-PCRで測定した。対照群（n = 5）、アルコール群（n = 25）、AL_FMT群（n = 17）。*p＜0.05および**p＜0.01。

FMTはアルコール依存症マウス血清中のLPSおよびFABP2レベルの上昇を抑制する
腸管透過性に対するFMTの影響を確認するために、図8A,Bに示すように、腸管バリア透過性のバイオマーカーとして機能するLPSおよびFABP2の血清レベルを測定するためにELISA分析を行った。対照群と比較して、アルコール依存症マウスの血清中のLPSおよびFABP2は増加したが、FMTはその変化レベルを有意に減少させたことから、腸管漏出に対するFMTの修復作用が示唆された。

図8
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図8. アルコール誘発炎症反応に対するFMTの効果。(A,B)血清中のLPSおよびFABP2濃度。 (C-E)脾臓中の炎症性サイトカイン濃度。コントロール群（n = 5）、アルコール群（n = 25）およびAL_FMT群（n = 17）。*p < 0.05および**p < 0.01。

FMTは脾臓におけるアルコール誘発性サイトカイン放出を抑制する
炎症性因子に対するFMTの影響をさらに調べるため、一連のELISAアッセイを行った。その結果、FMTはTNF-α、IL-4、IL-18のレベルを有意に低下させ（図8C-E）、FMTがアルコール依存症マウスの炎症反応を改善できることが示された。

考察
アルコールは依存性物質である。長期飲酒は、アルコールに対する心理的・生理的依存を引き起こし、アルコール依存症を形成する。アルコール依存症の患者は、抑うつ、不安、その他の脳疾患などのアルコール離脱症状を有する（Peacock et al.） 現在、アルコール治療にはいくつかの薬剤が使用されているが、これらの薬剤は効果が低く、副作用もある（Fernandez et al.） したがって、アルコール依存症治療のための新たな介入策を見つける必要がある。微生物-腸-脳軸は、中枢神経系、神経内分泌系、神経免疫系を含む双方向のコミュニケーション経路である。腸内微生物の再構築を通じて神経疾患を改善することは、有望な研究分野と考えられている（Cryanら、2020年）。本研究では、アルコール依存マウスに対するFMTの効果を調べた。その結果、FMTは脳腸軸の炎症を抑制し、5-HTの産生を増加させることにより、アルコール依存症の症状を改善することが示された。

一般に、神経系疾患における腸内細菌叢の関与に関する研究は人々の注目を集めているが（Erny et al., 2021; Fulton et al., 2021）、薬物依存、特にアルコール依存に関する論文はごく一部である（Angoa-Perez and Kuhn, 2021）。本研究では、自由飲酒をシミュレートするために、2本飲みモードで摂食させることでアルコール依存症モデルマウスを構築した。一定期間の訓練後、アルコール依存マウスはアルコールに対する有意な嗜好性を示し、うつ病を好む行動を示したことから、アルコール依存モデルの確立に成功したことが示された。さらに、健常マウスの腸内細菌叢をアルコール依存マウスに移植することで、抑うつ様行動とアルコール依存を緩和することができた。FMTのメカニズムを解明するため、追跡調査を行った。

アルコール依存症の形成メカニズムは複雑であり、中でもうつ病は依存症の原因のひとつである（Leclercq et al.） 主要な神経伝達物質である5-ヒドロキシトリプタミン（5-HT）は、オピオイドペプチド、γ-アミノ酪酸、グルタミン酸などの分泌を調節することができ、情動、認知、物質依存などの多くの側面において重要な調節的役割を担っている（Bellono et al.） 5-HTと飲酒行動には負の相関がある。アルコール依存症のマウスやサルなどの実験では、5-HTによって合成される前駆物質を飼料に添加することで、動物の飲酒行動を抑えることができる（Agirmanら、2021）。5-HTとその受容体の機能異常は、精神障害［物質中毒やうつ病など］の発生や発症と重要な関係がある（Chenら、2022）。そこで、脳内の5-HT濃度を測定したところ、アルコール依存症マウスの脳内5-HT濃度は対照マウスに比べて30％減少していた。

体内の5-HTの95％以上は腸神経系（ENS）で産生されており、腸球菌など一部の細菌種は5-HTを産生する（Clarke et al.） しかも、トリプトファンは5-HTの必須アミノ酸前駆体である。腸内細菌叢は食物中のトリプトファンを、神経活性を有する一連の低分子代謝産物に分解する： トリプトファン水酸化酵素による5-HTの生成；粘膜の完全性と透過性の維持に関係するトリプトファン脱炭酸によるTRYの生成またはIAAとILAの生成；神経系の炎症に関係するキヌレン酸の生成（Kennedy et al.） そこで、FMTによる腸内細菌叢の再構築がアルコール依存症および5-HTの発現に及ぼす影響を検討した。その結果、FMTはアルコール依存性マウスの不安様行動とアルコール探索行動を緩和した。一方、アルコール依存症マウスの脳内5-HT含量は、FMT後に有意に増加した。さらに、海馬における5-HT受容体の発現低下が、アルコール摂取による認知機能の低下や抑うつに関連していることを示す証拠が蓄積されている（Brunetti et al., 2012; Bhattarai et al., 2017; Borroto-Escuela et al.） そこで、海馬領域における5-HTの受容体をqRT-PCRおよび免疫化学的に決定した。その結果、FMTは海馬における5-HT1Aと5-HT2Aの発現を改善した。このことは、FMTが海馬の5-HT含有量とその受容体である5-HT1Aと5-HT2Aを増加させることにより、アルコール誘発性うつ病を緩和する可能性を示している。

その結果、細胞は多数の炎症性サイトカイン（IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α）を産生し、ミクログリア細胞を活性化し、脳神経損傷を引き起こし、これがアルコール渇望の症状と関連する。同様に、我々のアルコール依存マウスにおいても、LPSと一連の炎症性サイトカインが有意に増加していた。

アルコール摂取は腸内細菌叢のアンバランスを引き起こし、腸の稠密性を損ない、その結果、腸管透過性が亢進し、リポ多糖（LPS）などの細菌産物が血液循環を介して腸粘膜から肝臓に到達し、TLR4の活性化を刺激し、NLRP3炎症因子を活性化する「腸管漏出」を引き起こす可能性がある（Jadhavら、2018年）。本研究では、タイトジャンクションの重要なタンパク質に対するFMTの影響を調べた。免疫蛍光組織化学とqRT-PCRにより、FMTはアルコール曝露によって引き起こされたZO-1とオクルジンの発現レベルの低下をアップレギュレートすることが示された。さらに、腸管上皮細胞間充織のバイオマーカー分子であるFABP2も、FMTによって発現が上昇した。一般に、腸内細菌叢のバランスが崩れ、腸の稠密性が損なわれると、腸管透過性が亢進し、リポ多糖（LPS）などの細菌産物が血液循環を介して腸粘膜から肝臓に到達し、TLR4の活性化を刺激し、NLRP3炎症因子を活性化する「腸管漏出」が起こる。その後の炎症反応は、アルコールによるうつ病の一因となる（Leclercq et al.） FMTが腸管バリアを修復する効果を持つという我々の結果を考慮し、我々はさらに血清中のLPSを測定した。アルコール依存性マウスのLPSレベルは、予想通りコントロールマウスよりも高かった。一方、FMTはこの変化を逆転させた。おそらく腸管漏出が改善したためであろう。さらに、脾臓の炎症反応が脳と腸の機能に影響することがいくつかの研究で示されており、脳腸軸における重要性が示されている（Saandら、2019；Zhangら、2021）。その結果、異なる群で炎症性サイトカインの脾臓レベルを測定した。予想通り、FMTはTNF-α、IL-4、IL-18の発現レベルを有意に低下させた。複合的に、FMTは炎症を軽減することにより、アルコール依存性マウスの脳腸管機能障害を緩和した。

微生物治療後にFMTが腸内細菌叢を調節したかどうかを調べるため、16S rDNA（V3＋V4）遺伝子配列決定を異なる群のマウスで行い、細菌分類学的組成を解析した。動物門レベルでは、アルコールマウスでは対照マウスに比べ、Verrucomicrobiaの存在量が減少し、Epsilonbacteraeotaの存在量が増加した。糞便微生物叢移植後、VerrucomicrobiaとEpsilonbacteraeotaの存在量はコントロール群に近かった。属レベルでは、AL_FMT群では2属（Ruminococcaceae UCG-014およびAkkermansia）の含量が有意に増加し、Helicobacter、Odoribacter、LachnospiraceaeおよびAlistipesの含量は有意に減少した。UCG-014はルーメン細菌科に属し、その存在量の変動は神経疾患と関連している（Pizarroら、2021年）。ヒトを対象とした研究ではさらに、UCG-014がアルコール摂取患者における5-HT含量と正の相関があることが確認されている（Haoら、2023）。Akkermansiaは、腸管バリア機能を高めるだけでなく、海馬の5-HTをアップレギュレートすることにより、ネズミのうつ病性障害を改善する、潜在的に有益な細菌であると考えられている（Guoら、2022）。Lachnospiraceaeはトリコモナス科に属する。Spirillaceaeの存在量の減少は、認知障害と関連している可能性があり、物質依存患者において有意に濃縮されていることが判明している。アリスティペスの存在量は、物質依存患者において正の相関を示した（Vincent et al.） しかし、アルコール依存症における微生物叢の具体的な作用機序については、さらなる研究が必要である。FMTは、潜在的に有益な細菌であるVerrucobacteria、Lactobacillus、Ruminococcaceae_UCG-014およびAkkermansiaの存在量を逆転させ、潜在的に有害な細菌の存在量を減少させることにより、依存性マウスの不安様行動およびアルコール探索行動を改善する可能性がある。

結論として、本研究は、FMT治療がアルコール依存性マウスの不安様行動とアルコール探索行動を緩和することを明らかにした。さらに、FMT投与は腸管バリアの完全性を高め、腸内細菌叢の組成を変化させた。さらに、FMTはアルコール依存マウスの炎症反応を改善し、5-HTおよびその受容体（5-HT1Aおよび5-HT2A）の発現を増加させた。この結果は、FMTによる腸内細菌叢の再構築が、炎症反応の抑制とマウス脳内の5-HT系の制御を介して、おそらくアルコール離脱症候群を緩和する可能性があることを示し、FMTがアルコール依存症治療の有望な介入戦略である可能性を支持するものであるが、安全性に関するより多くのデータとヒトでの臨床試験が必要である。

データの利用可能性
本研究で発表されたデータセットは、オンラインリポジトリで見ることができる。リポジトリ名とアクセッション番号は論文／補足資料に記載されている。

倫理声明
この動物実験は、中国の倫理委員会の承認を受け、倫理基準に従って実施された。本研究は、現地の法律および施設要件に従って実施された。

著者貢献
QLは本研究を発案し、指揮した。DLは実験操作と原稿執筆を行った。WLはデータの解析を行った。ZHとWZは実験に協力した。HLは原稿に貴重な示唆を与えてくれた。著者全員が論文に貢献し、提出された原稿を承認した。

資金提供
本研究は、上海科学技術革新行動計画（助成金22DZ2202500）および中国博士研究員科学基金（助成金2021M692138）の助成を受けた。

利益相反
著者らは、本研究が、利益相反の可能性があると解釈されるような商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。

発行者注
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本記事で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。

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キーワード：アルコール依存症、糞便微生物叢移植、5-HT、脳腸機能障害、腸内細菌叢

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受理された： 2023年6月16日；受理：2023年12月20日；
発行：2024年01月05日

編集：オマール・エル・ヒバ

オマール・エル・ヒバ、シュエイブ・ドゥッカリ大学、モロッコ
査読者

Hayat Bouighajd（モロッコ、スルタン・ムーレイ・スリマン大学
リチャード・アガンス、空軍研究所（米国
Chaima Azzouhri（モロッコ、スルタン・ムーレイ・スリマン大学
Copyright © 2024 Li, Liang, Zhang, Huang, Liang and Liu. これはクリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事です。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。

*連絡先：Haipeng Liang, Haipeng Liang, qylhp@126.com; Qing Liu, liuq@usst.edu.cn

免責事項：本論文で表明されたすべての主張は、あくまで著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。この記事で評価される可能性のある製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張は、出版社によって保証または承認されるものではありません。

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BNT162b2 mRNAワクチンブースター接種後の血管免疫芽球性T細胞リンパ腫の急速な進行： 症例報告
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