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掲載：2023年9月16日
軽度の睡眠制限は女性における内皮酸化ストレスを増加させる

https://www.nature.com/articles/s41598-023-42758-y

Riddhi Shah, Vikash Kumar Shah, ...Sanja Jelic 著者一覧を見る
サイエンティフィック・リポーツ13巻、論文番号：15360（2023） この記事を引用する

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指標詳細

概要
睡眠制限は心血管リスクの上昇と関連しており、それは男性よりも女性で顕著である。われわれは最近、健康な女性において、「現実の生活」を模倣した軽度かつ長時間の睡眠制限が、心血管疾患の発症および進行における重要なステップである内皮機能を障害するという、初めての因果関係を示す証拠を報告した。しかし、その基礎となるメカニズムは不明である。モデル生物では、睡眠制限は酸化ストレスを増加させ、抗酸化制御因子である核因子（赤血球由来2）様2（Nrf2）の誘導を介して抗酸化応答をアップレギュレートする。ここでは、健康な女性（n = 35）を対象に、6週間の軽度の睡眠制限（習慣的な睡眠時間より1.5時間短い）を行った後、無作為クロスオーバーデザインを用いて、内皮細胞の酸化ストレスと抗酸化反応を直接評価した。睡眠制限は、抗酸化反応をアップレギュレートすることなく、内皮の酸化ストレスを顕著に増加させた。RNA-seqと予測蛋白質間相互作用データベースを用いて、Nrf2抗酸化応答を制御する蛋白質である内皮Defective in Cullin Neddylation-1 Domain Containing 3（DCUN1D3）の発現低下を、睡眠制限における内皮抗酸化応答障害のメディエーターとして同定した。従って、睡眠制限により内皮の酸化ストレスの除去が障害され、長期的に心血管リスクが増加する。

試験登録 NCT02835261 

はじめに
米国の成人の3分の1以上が、推奨されている1日7～8時間未満の睡眠しかとっていない1,2。不十分な睡眠は心血管リスクの上昇と関連しており、米国心臓協会はLife's Essential 82,3,4において睡眠時間を心血管の健康の8番目の指標に含めるに至った。女性の方が男性よりも睡眠障害を訴える頻度が高く、睡眠不足に伴う炎症反応や心血管リスクがより顕著である2,4,5,6,7,8。我々は最近、無作為に割り当てられた軽度かつ長時間の睡眠制限が、健康な女性において、心血管疾患発症の初期段階である内皮の炎症と機能障害を引き起こすことを報告した7。しかし、その根本的なメカニズムは依然として不明である。

健康的な睡眠の主要な機能として、内皮の炎症と機能障害の重要な一因である酸化ストレスの予防が示唆されている9,10,11。睡眠不足は、喫煙、高脂血症、高血圧、糖尿病など他の心血管危険因子と同様、細胞内に酸化ストレスを発生させる11。ショウジョウバエやげっ歯類モデルを用いた研究では、睡眠を制限すると酸化ストレス（活性酸素種の発生増加として定義される）が増加し、抗酸化制御因子である核因子（赤血球由来2）様2因子（Nrf2）の誘導を介して抗酸化反応がアップレギュレートされることが示されている。Nrf2は、その抑制因子であるカリン-3（Cul3）を含むユビキチンリガーゼ複合体との相互作用によって潜在状態に保たれている酸化還元感受性の転写因子である12,13,14。酸化ストレスの増大に応答して、Nrf2とCul3に結合するアダプタータンパク質Kelch-like ECH-associated protein 1（Keap1）が修飾され、ユビキチンリガーゼ複合体が不活性化されることで、Nrf2が蓄積し、核内に移動して抗酸化応答エレメント（ARE）に結合し、抗酸化遺伝子の転写を開始する15。

臓器特異的な抗酸化遺伝子の過剰発現は、重度の睡眠不足に陥ったショウジョウバエの生存を回復させ11、Nrf2-ARE経路の活性化は心血管疾患からの保護をもたらす16。モデル生物における睡眠不足が酸化ストレスに及ぼす影響に関する研究では、重度の急性睡眠制限や、モデルの寿命を制限する遺伝子操作が用いられている11,17。このような極端で短期的な睡眠制限と、現代社会におけるワークライフバランスの維持に起因する慢性的で軽度な睡眠制限という一般的な睡眠パターンとの関連性は限られている2,4,11,17,18。現実の」睡眠パターンを模倣した慢性的で軽度の睡眠抑制が、内皮の酸化ストレスや抗酸化反応に影響を及ぼすかどうかは不明である。無作為クロスオーバーデザインを用いて、健康な女性参加者から採取したばかりの内皮細胞（EC）を用いて、6週間の軽度睡眠制限または十分な睡眠を客観的にモニターする前と後で、酸化ストレスと抗酸化反応を直接評価した。

結果
睡眠制限は内皮の酸化ストレスを増加させる
2週間のアクチグラフィースクリーニングを行い、習慣的な睡眠時間が適切（毎日7-9時間）であることを確認した後、健康な女性参加者を6週間の十分な睡眠段階（アクチグラフィースクリーニングで決定された規則的な就寝時刻と起床時刻の間の睡眠時間）または6週間の軽度な睡眠制限段階（就寝時刻を1.5時間遅らせ、起床時刻を一定に保つ）に無作為に割り付け、その後6週間のウォッシュアウト期間と代替睡眠段階へのクロスオーバーを行った（補足図S1）。51人の参加者が十分な睡眠をとる群と睡眠を制限する群に無作為に割り付けられた。無作為化を受けた51人の参加者のうち、16人は少なくとも1つの試験相を完了せず、解析に利用できるデータがなかった（13人はいずれの睡眠相も開始できず、3人は最初の睡眠相を完了しなかった）。3人の参加者は十分な睡眠をとったが、睡眠制限の段階は完了せず、32人が試験の両段階を完了した。したがって、35人の参加者が少なくとも1つの相を完了し、intention-to-treat解析に利用可能なデータが得られた（n = 35；平均±SD年齢36±14歳；肥満度指数[BMI]25±3kg/m2；人種的少数派49％；ベースライン睡眠時間7時間28分±28分）。睡眠制限期の平均睡眠時間短縮は、十分睡眠期と比較して1晩あたり1時間20分であった（平均±SD 6時間09分±26分 vs 7時間28分±20分、p＜0.001）。睡眠時間は両試験期間中、連続アクチグラフにより客観的にモニターされた。

睡眠制限に対する内皮の反応を直接評価するために、培養条件のアーチファクトなしに直接調べることができ、心血管系疾患19,20,21,22,23,24における動脈内皮と同様の機能不全反応を有する静脈ECを採取する低侵襲技術を用いた。我々はまず、モデル生物11,17で起こるように、睡眠制限がECの酸化ストレスを増加させるかどうかを評価した。このプローブは活性酸素種によって活性化された後、核DNAに結合する25。十分な睡眠時と睡眠制限時のベースライン時のECの酸化ストレスレベルは同程度であった（蛍光強度［平均±SD］21.22±16.43 vs. 24.22±14.25, p = 0.49）。内皮酸化ストレスのレベルは、十分な睡眠と比較して、睡眠制限後に78％増加し（蛍光強度［平均±SD］36.06±21.55 vs. 20.23±15.04, p = 0.002）、ベースライン値で調整した後も有意に大きいままであった（推定値±SE 14.81±4.41, p = 0.001）（図1A）。

図1
図1
睡眠制限は抗酸化反応をアップレギュレートすることなく内皮酸化ストレスを増加させる。(A）十分な睡眠後（n = 31）と睡眠制限後（n = 32）の健康な参加者から採取した内皮細胞におけるベースライン値で調整した酸化ストレス（活性酸素種によって活性化され、その後DNAに結合する蛍光プローブの核蛍光強度）を定量化した代表的な画像とBox and Whisker Plot。事前に特定した共変量には、酸化ストレスと中等度または強い関連を示したものはなかった（p値＜0.1）。(B)十分な睡眠後（黒丸；n=28、28、25、18、18）と睡眠制限後（赤丸；n=32、32、25、16、15）の参加者から採取した内皮細胞におけるカタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ヘムオキシゲナーゼ-1、チオレドキシン還元酵素-1、NAD(P)Hキノン酸化還元酵素-1の内皮mRNA発現を定量化した箱ひげ図。図中のデータはすべて平均値±SDで示した（線形混合効果モデル）。NS = 有意でない。

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睡眠制限下では抗酸化反応が損なわれる
モデル生物における睡眠制限後の抗酸化反応の増加に関する報告17,26,27に基づき、我々は健康な女性参加者において、睡眠制限によって誘発された内皮酸化ストレスに応答して抗酸化遺伝子の発現が増加することを予想した。予想通り、培養内皮細胞を過酸化水素添加による酸化ストレスにさらすと、抗酸化遺伝子の発現が著しく上昇した（補足図S2）。しかし、AREを含む遺伝子であるヘムオキシゲナーゼ1（HO-1）、チオレドキシン還元酵素1（TXNRD-1）、NAD(P)Hキノン酸化還元酵素1（NQO-1）、抗酸化酵素活性のマーカーであるスーパーオキシドジスムターゼ1（SOD1）、カタラーゼのmRNA発現レベルは、十分な睡眠をとった後と睡眠制限をした後の参加者から採取したECで同程度であった（図1B）。1B）。このことは、長期にわたる軽度の睡眠制限では、内皮の抗酸化反応が適切に活性化されないことを示唆している。

ショウジョウバエやげっ歯類モデルでの研究から、睡眠制限は、核内に転移して抗酸化遺伝子の転写を開始する酸化還元感受性転写因子である抗酸化制御因子Nrf2の誘導を介して、抗酸化応答をアップレギュレートすることが示されている12,13,14,15。抗酸化反応の欠如を説明する可能性のあるメカニズムを探るため、まず、睡眠制限後のECでNrf2の発現と細胞局在が変化しているかどうかを調べた。酸化ストレスにさらされると、培養ECにおいてNrf2の核局在が増加することが確認された（補足図S3）。対照的に、参加者から採取したECでは、Nrf2のmRNAと総タンパク質の発現は、十分な睡眠と睡眠制限で同程度であった（補足図4A-C）。細胞質では容易に検出されたNrf2の核内蛍光は、十分な睡眠と睡眠制限の両方でほとんど検出されなかったことから（補足図S4D）、内皮の酸化ストレスが増加したにもかかわらず、Nrf2は睡眠制限後にECの核内に移行しないことが示された。

睡眠制限における内皮Nrf2の細胞内局在
次に、Nrf2が睡眠制限後に採取したECの核に移行しない理由を調べた。Nrf2の機能は、Cullin-Ring-Ligase複合体の一部であるCul3-Keap1-E3リガーゼによって制御されている14。基底状態では、Cul3のneddylationはE3-Cul3-Keap1複合体を活性化し、Nrf2をユビキチン化し、プロテアソーム分解の標的とすることで、Nrf21の基底レベルを低く維持している14,28,29。酸化ストレスが増加した条件下では、Nrf2のユビキチン化が抑制され、その結果、Nrf2の利用可能性が増加し、核内に移動してAREに結合し、その結果、抗酸化遺伝子が活性化される14,28,29。Cul3のタンパク質発現とmRNA発現は、十分な睡眠時と睡眠制限時で同様であった（補足図S5A-B）。対照的に、Cul3とNrf2の細胞質での共局在は、十分な睡眠と比較して睡眠制限後に有意に増加した（図2A）ことから、Nrf2のユビキチン化複合体内での保持が増加したことが示唆される。

図2
図2
睡眠制限における抗酸化反応の障害メディエーターの同定。(A）十分な睡眠と睡眠制限後の内皮Nrf2-Cul3共局在（黄色で示す）を定量化した代表的な画像とBox and Whisker Plot（n = 25）。(B）健康な参加者（n = 5）から採取した内皮細胞における、十分な睡眠と比較した睡眠制限後の遺伝子発現の差（n = 25,001遺伝子）を示すボルケーノプロット。横の点線は、p<0.05の13の差次的発現遺伝子とp≥0.05の差次的発現遺伝子を分けている。睡眠制限によって変化した遺伝子の中でCul3の唯一の結合標的であるDCUN1D3遺伝子（緑枠）の発現は、十分な睡眠と比較して、睡眠制限後に8.46 log2倍変化（FC）減少した（p = 0.045）。(C) 十分な睡眠後（n = 28）と睡眠制限後（n = 32）の内皮DCUN1D3 mRNA発現を定量化したBox and Whisker Plot。(D）十分な睡眠と睡眠制限後の内皮SRF mRNA発現を定量化した箱ひげ図とウィスカー図（n = 25）。図中のデータはすべて平均値±SDで示した（線形混合効果モデル）。Cul3 = Cullin-3; DCUN1D3 = defective in cullin neddylation 1 domain containing 3; Nrf2 = Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2; SRF = serum response factor。

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睡眠制限における抗酸化反応のメディエーター
変化したNrf2とCul3-Keap1-E3複合体の相互作用の潜在的なメディエーターを同定するために、5人の参加者の十分な睡眠期と睡眠制限期の終わりに採取したECでバルクRNA-seqを行った（補足表S1）。睡眠制限により、13遺伝子の発現が変化した（図2B）。予測タンパク質間相互作用データベース（BioGRID）30を用いて、これら13遺伝子のタンパク質産物について、特にNrf2、Keap1、Cul3との結合確率を調べた。 Nrf2やKeap1との結合が予測されたものはなかったが、睡眠制限によって変化した遺伝子の中で、Cul3の結合パートナーとしてDefective in Cullin Neddylation-1 Domain Containing 3（DCUN1D3）を同定した。Cul3はDCUN1D330の予測される結合パートナーのトップであった。非内皮細胞では、DCUN1D3はCul3を細胞膜に隔離することでCul3のneddylationを阻害し、Nrf2の分解を抑制し、Nrf2の核内移行と抗酸化反応の活性化を促進する31,32。我々は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECs）においてDCUN1D3がCul3と相互作用することを確認した。参加者から採取したECのRNA-seq解析では、内皮DCUN1D3のmRNA発現は、十分な睡眠と比較して睡眠制限後に減少し（log2 fold change = - 8.46; p = 0.045）、これはRT-PCRで確認された（図2C）。内皮DCUN1D3の発現低下とCul3とNrf2間の相互作用の増加は、Cul3の細胞膜への隔離が減少し、Cul3-Keap1-E3ユビキチンリガーゼ複合体におけるCul3の利用可能性が増加したことを示唆している。

睡眠制限におけるDCUN1D3の制御
次に、睡眠制限とDCUN1D3の発現低下に関連する可能性のある機序について調べた。DCUN1D3遺伝子は、血清応答エレメント（SRE）を含む新規ヒト遺伝子のハイスループットスクリーニングで初めて同定された33,34。SREは、様々な細胞プロセスを制御する転写因子である血清反応因子（SRF）と結合する35。興味深いことに、SRFは最近、マウスの短期睡眠制限に対する大脳皮質の反応をプライミングする有力な転写因子候補として浮上した36。SRFはシナプス強度の活動依存的調節に重要な役割を果たしており、そのオルソログであるblisteredはショウジョウバエの社会的濃縮後の睡眠時間の延長に必要である35,37,38。SRFの発現は概日パターンに従っており、その発現量はマウスの短期睡眠制限後の覚醒期に減少する。実際、採取したECにおけるSRF mRNAの発現は、十分な睡眠と比較して睡眠制限後に減少した（図2D）。このことは、就寝時間を遅らせることによって睡眠を抑制すると、DCUN1D3を制御する転写因子の発現が変化することを示唆している。興味深いことに、SREを含む成長ホルモン（GH）応答性遺伝子の活性化には、他の転写因子と協調してSRFがSREに結合することが必要である39。DCUN1D3はSREを含んでいるので、SRFによるその制御がGHによって媒介されるかどうかを調べた。睡眠開始直後の徐波睡眠中にGHの主要なパルス性放出が起こり、睡眠を制限するとGHの放出が鈍ることから、これは興味深いことである40。GHパルスの数とGHの放出は、男女ともに2300時から0200時の間に最大となる41。したがって、就寝時刻を1.5時間遅らせて6週間寝ると、GHの拍動性放出が阻害された可能性がある。GHの評価には24時間にわたる頻繁な採血が必要であり、長期にわたる外来研究では不可能であるため、SRFとDCUN1D3の発現に対するGHの影響を評価するために、HUVECをGHとインキュベートした。予想通り、GHの添加はSRFのmRNA発現を変化させなかったが、DCUN1D3のmRNA発現を上昇させた（補足図6B）。siRNAを用いてHUVECのSRFをサイレンシングすると（補足図6C）、ベースラインでも4時間の酸化ストレス暴露後でも、コントロールと比較してDCUN1D3のmRNA発現が抑制された（補足図S6D）。興味深いことに、SRFをノックダウンしたHUVECでは、ベースラインでも4時間の酸化ストレス暴露後でも、コントロールと比較してDCUN1D3のmRNA発現はGH添加後も抑制されたままであり（補足図S6D）、SRFがDCUN1D3の発現に対するGHの効果を仲介していることが示された。

DCUN1D3が独立してECの抗酸化応答を制御しているかどうかを調べるために、siRNAを用いてHUVECのDCUN1D3をサイレンシングした（補足図S7）。驚くべきことに、AREを含むNrf2の主要な標的遺伝子であるHO-1 mRNAの酸化ストレスに対する発現は、DCUN1D3をノックダウンしたHUVECにおいてほぼ完全に抑制された（図3A）ことから、DCUN1D3が独立してECにおけるNrf2を介した抗酸化応答を制御していることが示唆された。これらの所見は、DCUN1D3がECにおけるNrf2を介した抗酸化反応の活性化に必要であることを示唆している。さらに、NRF2のmRNA発現は、ベースラインでも酸化ストレス暴露後でも、DCUN1D3がサイレンシングされたHUVECとコントロールで同程度であった（図3B）。NRF2タンパク質の発現は、ベースラインではDCUN1D3をノックダウンしたHUVECとコントロールで同様であった。しかし、酸化ストレスに暴露した後、NRF2タンパク質の発現は、コントロールと比較して、DCUN1D3をノックダウンしたHUVECで有意に減少した（図3C）。このことは、睡眠制限で見られるように、DCUN1D3の内皮発現が減少すると、NRF2は実際にプロテアソーム分解を受ける可能性があることを示唆している。

図3
図3
DCUN1D3は内皮の抗酸化反応を制御する。(A）DCUN1D3をノックダウンしたHUVECとコントロール（n = 5）における酸化ストレス暴露前後のヘムオキシゲナーゼ-1mRNA発現を定量した散布図。(B）DCUN1D3をノックダウンしたHUVECとコントロール（n = 3）におけるベースライン時と酸化ストレス暴露後のNrf2 mRNA発現を定量した散布図。(C）HUVEC（n＝4）におけるベースライン時および酸化ストレス暴露後のDCUN1D3ノックダウンにおけるNrf2タンパク質発現をコントロールと比較して定量したウェスタンブロッティングおよび散布図。図中のデータはすべて平均値±SDで示した。NS = 有意でない。略号は図2と同じ。

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考察
我々は、厳密なランダム化クロスオーバーデザインと新鮮な採取したECを用いて、健康な女性において睡眠不足が内皮の酸化ストレスを増加させることを直接的に示した。驚くべきことに、内皮酸化ストレスが顕著に増加しているにもかかわらず、睡眠を制限すると内皮の抗酸化反応は全く見られなくなった。我々は、睡眠制限によって誘発された酸化ストレスに対する内皮の抗酸化反応の欠如を媒介する新たな機序として、ECにおけるNrf2を介した抗酸化反応を促進するタンパク質である内皮DCUN1D3の発現低下を同定した。就寝時間を遅らせて睡眠を抑制すると、内皮DCUN1D3制御因子SRFの発現が減少した。SRFは、睡眠制限に対する皮質の反応を促す転写因子である36。これらの所見は、成人の間で非常に一般的な行動パターンである睡眠の抑制が、血管の健康に有害な影響を及ぼすという直接的な証拠を示している（図4）。

図4
図4
睡眠制限後の覚醒時の内皮細胞機能は、十分な睡眠と比較して障害される。十分な睡眠後、覚醒時に蓄積した内皮の酸化ストレスは、適切な抗酸化反応によって消去される。SRFのmRNA発現は、覚醒時に睡眠圧が上昇した後に増加し、DCUN1D3をアップレギュレートし、Cul3を細胞膜に隔離する。Nrf2ユビキチン化複合体におけるCul3の利用可能性が低下すると、Nrf2が放出され、核内移行と抗酸化遺伝子の活性化が可能になる。睡眠制限後、内皮の抗酸化反応は適切にアップレギュレーションされず、内皮の酸化ストレスが増加する。睡眠制限後の覚醒時にSRF mRNAの発現が減少すると、DCUN1D3の発現が減少し、その結果、Nrf2ユビキチン化複合体におけるCul3の利用可能性が増加し、Nrf2が捕捉され、その核内移行と抗酸化遺伝子の活性化が妨げられる。睡眠不足後の内皮の抗酸化反応の障害は、覚醒時の酸化ストレスの増加をもたらし、内皮機能を障害し、心血管リスクを増加させる可能性がある。

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睡眠不足は、モデル生物において細胞内酸化ストレスの増加と長い間関連してきた。ショウジョウバエやマウスモデルでは、短期間の睡眠制限によってミトコンドリアの電子伝達鎖が障害され、活性酸素種の産生が増加し、酸化ストレスが増大した11,42,43。炎症性転写因子NF-κBは細胞の酸化還元状態によって制御されており、静脈ECでは活性酸素種がNF-κBを活性化する44。われわれは最近、軽度かつ長時間の睡眠制限がECにおいてNF-κBを活性化することを報告し、健康な女性における睡眠制限後のECにおける酸化ストレスの増加と炎症との間のメカニズム的な関連を示唆した7。女性は、十分な睡眠中も睡眠制限中も、男性よりも炎症反応が強いことから、これが睡眠不足に伴う心血管リスクの性差を引き起こす重要な基礎メカニズムである可能性が示唆される4,5,45。

われわれは、Cul3を細胞膜に隔離するタンパク質DCUN1D3を、睡眠不足における抗酸化反応の障害の新たなメディエーターとして同定した。Cul3を含むユビキチンリガーゼ複合体は、抗酸化反応の主要な活性化因子であるNrf2をプロテアソーム分解の標的としている。ショウジョウバエの短時間睡眠を引き起こす不眠症突然変異は、ユビキチンリガーゼアダプター機能の喪失をもたらし、Cul3の欠失はショウジョウバエの短時間睡眠の表現型を模倣する46。睡眠制限におけるDCUN1D3の発現低下は、Cul3の細胞膜への隔離を妨げ、それによってNrf2とCul3を含むユビキチンリガーゼ複合体との継続的な相互作用を可能にし、抗酸化遺伝子の活性化を妨げる32,47,48,49,50。我々のデータは、就寝時間を遅らせることと、DCUN1D3活性化因子であるSRFのダウンレギュレーションを関連付けている31,32。SRFは睡眠圧の概日制御下にある転写因子であり、睡眠不足は覚醒時のSRF発現を低下させる36。就寝時間を遅らせることで睡眠を抑制すると、GHの放出が変化し、それが下流でSRF/DCUN1D3/Cul3/Nrf2を介したECの抗酸化反応に抑制的な作用を及ぼす可能性がある40。このように、われわれは、睡眠不足とSRF/DCUN1D3/Cul3/Nrf2を介した血管内皮の抗酸化反応とを関連付ける新たな軸を同定した。

睡眠制限における内皮Nrf2核内転位の欠如は、Nrf2活性化因子の治療応用の可能性に疑問を投げかける51,52。低用量のNrf2活性化因子dh404は糖尿病マウスのアテローム性動脈硬化症を抑制し、その抗酸化作用と抗炎症作用は糖尿病関連アテローム性動脈硬化症の改善と相関している53。しかし、Nrf2活性化因子の安全性プロファイルは、睡眠不足における治療的役割を考える前に改善される必要がある51,52。見かけ上健康な女性における睡眠不足による内皮機能障害の所見は、心血管系の健康にとって十分な睡眠が重要であることを医療機関でカウンセリングすることの重要性を強調するものである。

研究の限界には、静脈内皮細胞を用いたことが含まれ、睡眠制限における動脈硬化に関する結論は除外される。しかし、炎症および酸化経路は、健常者およびアテローム性動脈硬化症患者の静脈および動脈のECにおいて同様に活性化され、静脈および動脈のECは、十分な睡眠および睡眠制限において同じ循環環境に曝される22,23,24。この研究では、睡眠制限後のアテローム形成の可能性については触れていない。動脈硬化を起こしやすい動脈血管の特定部位における内皮生検は、睡眠制限に反応する動脈硬化の根底にある正確な機序を明らかにするために必要であるが、健常人を対象とした外来研究では不可能である。男性参加者がいなかったため、睡眠不足に対する内皮反応の性差に関する結論は得られなかった。本研究では、参加者の月経周期を終始モニターしなかった；しかしながら、研究エンドポイントにおけるホルモンの状態を一定に保つため、月経周期が正常な閉経前の参加者を登録した。各睡眠段階の終点は、正常な月経周期の3周期分に相当する12週間ごとに区切られた。

結論として、不十分な睡眠は内皮の酸化ストレスを促進し、抗酸化反応を障害することから、睡眠を抑制することは内皮の機能障害につながり、長期的には心血管リスクを増加させることが示唆された。

方法
詳細な方法は補足情報にある。

すべての方法は関連するガイドラインおよび規則に従って行われた。

参加者は2016/09/01から臨床試験NCT02835261に登録された。

試験参加者
試験参加者は、広告を通じて地域社会から前向きに募集した。18歳以上の健康な女性参加者（すなわち、出生時に性別が女性に割り当てられている者）で、十分な睡眠時間が7～9時間/夜と定義されている者が試験に適格であった。十分な睡眠時間は、スクリーニング時に2週間のアクチグラフモニターによって確認された。除外基準は、医学的、神経学的、精神医学的疾患の既往歴、摂食障害、睡眠障害、薬やサプリメントの常用（経口避妊薬やホルモン補充療法を含む）、1年以内の妊娠、授乳中、月経周期不順（28日未満または35日以上）、BMI20未満または33.0kg/m2以上、喫煙歴、アルコールまたは薬物乱用歴、交代勤務、昼間の仮眠、スクリーニング前4週間以内の時間帯をまたぐ旅行、機械オペレーターまたは商業運転手としての就業であった。また、睡眠の質が悪い場合（Pittsburgh Sleep Quality Indexスコア＞6）、日中の過度の眠気（Epworth Sleepiness Scaleスコア＞10）、睡眠時無呼吸症候群のリスクが高い場合（Berlin Questionnaireスコア＞1）は研究対象外とした。本研究はコロンビア大学施設審査委員会の承認を得ており、参加者全員が書面によるインフォームドコンセントを行った。

51人の参加者が2016年9月から2019年12月の間に登録された。16人の参加者は少なくとも1つの試験相を完了せず、intention-to-treat解析に利用可能なデータがなかった。35人の参加者が少なくとも1つの試験相を完了した。3人の参加者は十分な睡眠を完了したが、睡眠制限相は完了しなかった；32人は試験の両相を完了した（補足図S1）。脱落した16人の参加者と少なくとも1つの研究相を完了した35人の参加者の人口統計学的特徴とスクリーニング中の睡眠時間は、以前に報告されたものと同様であった7。

睡眠制限介入
本研究では、アクチグラフを用いて睡眠時間を客観的に評価した。参加者は、2週間のアクチグラフィースクリーニングで睡眠時間が適切かどうか（毎日7～9時間）を判定された後、6週間の十分睡眠期（2週間のアクチグラフィースクリーニングで判定された女性の規則的な就寝時刻と起床時刻の間の睡眠時間）、または6週間の軽度睡眠制限期（就寝時刻を1.5時間遅らせ、起床時刻を一定に保つ）に無作為に割り付けられ、その後6週間のウォッシュアウト期間を経て代替睡眠期に移行した。十分な睡眠相では、参加者は2週間のスクリーニング睡眠スケジュールに基づいて、決まった就寝時間ルーチンに従うように求められた。睡眠制限期には、参加者は就寝時刻を1.5時間遅らせ、習慣的な起床時刻は変えないように求められた。

参加者は、オンライン研究用無作為化装置（https://www.randomizer.org）を用いて、十分な睡眠-睡眠制限、または睡眠制限-十分な睡眠のいずれかの睡眠相に無作為に割り付けられた。参加者は試験開始まで無作為化順序を知らないままであった。収縮期および拡張期血圧、BMI、血漿コルチゾール値、アクチグラフから得られた身体活動量およびエネルギー消費量（歩数［step/day］、中等度-精力的身体活動量［min/day］、代謝当量［kcal/kg/h］）は、以前の報告7と同様、睡眠制限による有意な影響は受けなかった。

血管内皮細胞の採取
血管内皮細胞の採取は、両試験期の開始時と終了時に絶食状態で午前10時から11時の間に行った。20ゲージの血管カテーテルを前腕静脈に挿入した。無菌状態で3本のJ字型血管ガイドワイヤー（Arrow, Reading, PA）を順次10cmまで静脈内に進入させた。ワイヤーの先端を外し、4℃に保ったEC解離バッファーで洗浄した。各採取で2000-5000個のECが得られた19,21。

免疫蛍光
活性酸素種によって活性化され、酸化ストレスのマーカーであるDNAに結合した蛍光プローブの核蛍光強度を、蛍光顕微鏡を用いて評価した。Nrf2とCul3の蛍光面積は、共焦点顕微鏡を用いて、採取したECでアクセスした。定量化にはImageJを用いた19,21。

定量的リアルタイム（RT）-PCR
SOD1、カタラーゼ、HO-1、TXNRD-1およびNQO-1、Nrf2、Cul3、DCUN1D3およびSRF遺伝子について、定量的RT-PCR（TaqMan One-Step RT-PCR Master MixおよびTaqMan Probes、Applied Biosystems）を用いて、採取したECから単離したメッセンジャーRNA（mRNA）の発現を定量した。HO-1、DCUN1D3およびSRF mRNAの発現もまた、過酸化水素200μMに4時間暴露する前後のHUVECで定量した22。結果は、ハウスキーピング遺伝子β-アクチンで標準化したCt値で表した。

統計解析
2標本のt検定（連続変数について）およびカイ二乗検定（カテゴリー変数について）を用いて、睡眠介入の順序が異なる（すなわち、習慣的睡眠に続いて制限睡眠が行われた群と、制限睡眠に続いて習慣的睡眠が行われた群）参加者間で、ベースラインの人口統計学的特性が同等であるかどうかを決定した。無作為化により、これらの2群（すなわち、習慣的睡眠が先か、制限された睡眠が先か）は同質であると予想されるが、偶然に異なる可能性もある。これらの2群が偶然に異なっていないことを確認するために、2標本のt検定を用いてベースライン特性が同等であるかどうかを評価した。これら2群のベースライン特性は同等であった。正規性はQQnorm plotにより視覚的に評価した。クロスオーバーデザインの性質上、2回目の睡眠相におけるエンドポイントが、1回目の睡眠相における参加者のランダム割り付けによる順序効果によって交絡されているかどうかを評価した。睡眠相の割り付け順序は、どの結果についても有意ではなかったことから、第2相のデータは第1相の睡眠相の残差効果と交絡していないことが示された（補足表S2）。

各参加者の2つの睡眠相の終点を平均し、線形モデルを用いて、参加者のベースライン値をコントロールしながら、睡眠相割り当て順序（十分な睡眠が先か、睡眠制限が先か）に対して回帰した。睡眠相の割り当て順序は有意ではなかったことから、2番目の睡眠相では順序の影響はエンドポイントに影響を及ぼさないことが示された。そこで、両睡眠相のデータを用いて、患者内相関を考慮した線形混合効果モデルを用いて解析を行った。これは臨床試験NCT02835261の探索的解析であった。この臨床試験の主要アウトカム（上腕動脈のflow-mediated dilation）については、以前に報告されている7。

intention-to-treat解析において、十分な睡眠と睡眠制限期終了時の内皮機能マーカーに対する睡眠制限の効果を線形混合効果モデルを用いて評価した。主な共変量は、睡眠相（すなわち、十分な睡眠または睡眠制限）であった。被験者内相関を考慮するため、参加者をランダム効果としてモデルに含めた。潜在的な交絡効果をさらに調整するために、対照共変量（年齢、人種、民族性、ベースラインおよびエンドポイントのBMI、収縮期および拡張期血圧、コルチゾール値、アクチグラフ由来の身体活動量およびエネルギー消費量： 歩数（step/day）、中等度-精力的身体活動［min/day］、代謝当量［kcal/kg/h］；概日相の指標：各相間の中途覚醒時間の変化；内皮マーカーのベースライン値）で、転帰と中等度または強い限界的関連（p値＜0. 1）を考慮した。エンドポイントに対する睡眠制限の効果を比較・可視化するために回帰係数プロットを用いた。エンドポイントの大きさとスケールが異なることを考慮し、回帰係数βは対応するエンドポイントの標準誤差で正規化し、それによって標準化係数βをエンドポイント間で比較できるようにした。in vitroのデータについては、すべての比較にt検定を用い、p値は0.05未満とした。

データの利用可能性
本論文の基礎となるデータは、対応する著者からの要請に応じて提供される。

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参考文献のダウンロード

謝辞
本研究は米国国立衛生研究所/国立心肺血液研究所（NIH/NHLBI）R01HL106041およびR01HL137234、米国心臓協会16SRN29050000（S. J. J.), NIH/NIDDK RO1DK106548 (R.V.S.), AHA 16SFRN27960011 (B.A.), AHA 16SFRN27950012 and 16SFRN27880000 (M-P.S-O.), American Academy of Sleep Medicine (AASM) Award # 216-FP-19 (R.S.).

著者情報
著者メモ
これらの著者は同等に貢献した： Vikash Kumar Shah、Memet Emin。

著者および所属
Columbia University Vagelos College of Physicians and Surgeons, Pulmonary, Allergy, and Critical Care Medicine, New York, NY, USA

Riddhi Shah、Vikash Kumar Shah、Memet Emin、Su Gao、Vikas Malik、Jianlong Wang & Sanja Jelic

米国ニューヨーク州ニューヨーク、コロンビア大学ヴァゲロス医師外科大学腎臓学部門

ローズマリー・V・サンポーニャ

米国ニューヨーク州ニューヨーク、コロンビア大学ヴァゲロス内科外科大学心臓病学部門

ブルック・アガーワル

コロンビア大学ヴェイゲロス内科・外科（米国ニューヨーク州ニューヨーク、ニューヨーク・プレスビテリアン・モルガンスタンレー小児病院

オードリー・チャン

米国ニューヨーク州ニューヨーク、コロンビア大学ヴァゲロス医師外科大学一般内科

マリー＝ピエール・サン・オンジェ

米国ニューヨーク州ニューヨーク、コロンビア大学ヴァゲロス医師外科大学、コロンビア人間発達センターおよびコロンビア幹細胞イニシアチブ

ヴィカス・マリク、王建龍

米国ニューヨーク州ニューヨーク、コロンビア大学ヴァゲロス内科外科大学、生物統計学部門

イン・ウェイ

貢献
R.S.、M.E.、V.M.、J.W.、S.G.、V.K.S.、A.C.が実験、データ収集、解析、考察を行い、R.V.S.が内皮細胞の採取を行い、B.A.とM-P.S-O.が研究参加者のリクルートとデータ解析、考察を行い、Y.W.が統計計画の立案と統計解析を行い、S.J.が実験の着想、研究の計画と管理、原稿執筆を行い、著者全員の修正と承認を得た。

責任著者
Sanja Jelicまで。

倫理申告
競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。

追加情報
出版社からのコメント
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っている。

補足情報
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転載と許可

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この記事の引用
Shah, R., Shah, V.K., Emin, M. et al. Mild sleep restriction increases endothelial oxidative stress in female persons. Sci Rep 13, 15360 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-42758-y

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受理
2023年2月13日

受理
2023年9月14日

出版
2023年9月16日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41598-023-42758-y

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