bioRxivには、COVID19関連の論文が多数掲載されています。注意：これらは正式な査読を受けていないため、健康関連の行動を指導したり、決定的なものとして報道されるべきではありません。
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睡眠と概日リズムの乱れが肺のトランスクリプトームを変化させ、ウイルス感染の素因となる
ルイス・テイラー、フェリックス・フォン・レンデンフェルド、アンナ・アシュトン、ハルシュミーナ・サンガニ、エリック・タム、ラウラ・ウッセルマン、マリア・ベレテンニコワ、ロバート・ダルマン、ジェーン・マッキーティング、スリダール・ヴァスデバン、ORCIDプロファイルを見るAarti Jagannath
doi: https://doi.org/10.1101/2022.02.28.482377
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00002024
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アブストラクト
交代勤務中に遭遇する睡眠および概日リズムの乱れ（SCRD）は、SARS-CoV-2を含む呼吸器系ウイルス感染症のリスクを高める。しかし、SCRD後に呼吸器系ウイルス感染率が高くなるメカニズムについては、まだ十分に解明されていない。そこで、我々は、マウスの肺のトランスクリプトームに対する急性睡眠不足の影響について調査した。その結果、睡眠不足は、自然免疫系と適応免疫系の抑制、概日時計の乱れ、SARS-CoV-2の複製に関与する遺伝子の活性化を引き起こし、ウイルス感染とそれに伴う疾患発症を促進する肺の環境を作り出すことで、肺の転写の様子に大きな変化をもたらすことが明らかになった。本研究は、SCRDがSARS-CoV-2を含む呼吸器系ウイルス感染症のリスクを高めるメカニズムについて説明するとともに、COVID-19の予防と治療のための治療手段を明らかにするものである。

はじめに
呼吸器系ウイルス感染症は、世界的な死亡原因の1つであり、医学的・経済的な課題となっています1,2。毎年、数十億の感染症が数百万の死亡につながり、その年間経済的負担は米国だけで1000億ドル以上と推定されています3,4。近年、COVID-19 5の原因物質である重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2型（SARS-CoV-2）が出現し、現在までに4億人以上のSARS-CoV-2感染者と570万人のCOVID-19死亡者が出ていることから、呼吸器ウイルス感染症のインパクトが強調されています (https://coronavirus.jhu.edu/map.html)。重症呼吸器疾患を引き起こす危険因子とメカニズムの理解が深まれば、新たな治療法の選択肢につながるでしょう。睡眠と概日リズムの乱れは、マウスおよびヒトにおいて呼吸器感染症のリスク上昇を引き起こすことが報告されており6-10、シフト勤務とそれに伴う睡眠不足および概日リズムのずれがCOVID-19の危険因子であることを示す証拠が積み重ねられている11-16。しかし、睡眠と概日リズムの乱れがどのようにしてウイルス感染率の上昇を引き起こすのか、そのメカニズム的な説明はまだなされていない。

免疫系は、睡眠と概日リズムの厳密な制御下にある。概日時計は、外界の昼夜周期に合わせることができる分子の転写/翻訳フィードバックループであり、ホルモン分泌、代謝、睡眠、免疫機能などの生理および行動における24時間の振動である概日リズムを生み出している19,18。実際、白血球の移動、宿主と病原体の相互作用、免疫細胞の活性化などはすべて日周リズムを示す20。さらに、ワクチン接種、様々な病原体や病原体由来の産物に対する免疫反応に日周リズムの違いがあることはよく知られている21,22。インフルエンザA型、A型肝炎、SARS-CoV-2ワクチンに対する免疫反応23-25、インフルエンザを含む複数のウイルスの感染力は、ウイルスチャレンジの時間に依存している26-29。実験モデル系で概日リズムを乱すと、炎症性サイトカインレベルが上昇し30、免疫細胞の機能およびトラフィッキングが障害されることが報告されている31。さらに、B型およびC型肝炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス3型、呼吸器シンシチアルウイルス、A型インフルエンザウイルスなど、臨床的に重要なウイルスの複製を促進することができ、ウイルス感染の制御における概日時計の中心的役割が強調される35。

睡眠は、概日リズムによって制御される最も重要な行動の一つであるが、睡眠とその恒常性は、概日時計とは無関係に変化し、乱されることがある36,37。睡眠障害はまた、免疫機能障害を引き起こし、ナチュラルキラー細胞活性の低下38、炎症性サイトカイン産生の変化39-42、血中白血球数の変化43をもたらす。重要なことは、睡眠阻害は、マウスの脳45、肝臓46、肺47,48を含む複数の組織44において概日リズムおよび免疫遺伝子の発現を損なうということである。睡眠不足のヒト被験者の血液サンプルでも、同様の概日時計と免疫系の崩壊が見られる49-51。この睡眠と概日リズムの二重の乱れ（SCRD）は、交代勤務者、特に夜間勤務者がしばしば遭遇し、呼吸器系ウイルス感染症の危険因子として確立している。風邪52、インフルエンザ6,7,26、そして一般的な上気道ウイルス感染症8,10はすべて、SCRDの後に著しく増加することが分かっている。SARS-CoV-2に関する最近の世界的な研究の結果、交代勤務、睡眠障害と重症COVID-19の発症リスクとの関連性が複数の研究によって報告されている12,14-16,53。

交代勤務者における呼吸器系ウイルス感染症のリスクの増加、および睡眠、概日リズム、免疫機能の間の確立した関連性にもかかわらず、SCRD後のウイルス感染率上昇を支える分子メカニズムはまだ十分に明らかにされていない。我々は、急性睡眠不足がマウスの肺のトランスクリプトームに及ぼす影響と、最近SARS-CoV-2感染を制御することが明らかになった宿主経路の撹乱を調べた54-57。その結果、6時間の睡眠不足は肺の転写構造を大きく変え、ウイルス複製に必須な宿主経路に関連する大部分の発現が異なり、免疫および概日リズムの制御遺伝子が抑制され、概日リズムが損なわれていることを明らかにした。さらに、SDはSARS-CoV-2感染に関与するいくつかの宿主因子の発現差を引き起こし、SARS-CoV-2の侵入、複製、輸送に影響を与えている可能性が高いことがわかった。これらのデータを総合すると、睡眠不足は肺を変化させ、呼吸器系ウイルスの感染と病原化を促進する環境を提供することが示唆された。

結果および考察
急性睡眠不足は肺のトランスクリプトームを変化させ、免疫関連遺伝子の発現を減弱させる
肺トランスクリプトームに対する急性睡眠不足の影響を評価するため、コントロールまたは6時間睡眠不足（SD）C57BL/6マウスから分離した肺組織に対してRNA配列決定（RNA-Seq）を実施した（図1a）。遺伝子発現解析の結果、SD後に2,366個の発現が増加し、2,157個の発現が減少していることが確認された（図1b, c）。qRT-PCRと独立したSD肺サンプルを用いてRNA-Seqデータセットを検証したところ、いくつかの上位差異遺伝子と時計遺伝子について相関した結果が得られ、トランスクリプトーム解析の頑健性が確認された（補足図1）。SDで発現上昇した遺伝子のGene Ontology (GO) 生物パスウェイ (BP) 強化解析では、シグナル伝達（キナーゼ活性、ステロイドホルモンへの応答）に加え、オートファジー、ゴルジ体組織、細胞内タンパク質局在など、ウイルス侵入やRNA複製にも関与する一般的生物プロセスが濃縮されていた（図1d）。同様の結果は、Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes (KEGG) パスウェイ解析でも確認され、ER、オートファジー、エンドサイトーシスにおけるタンパク質プロセッシングが強調された (図1e)。また、概日リズム遺伝子に濃縮が見られた（Fig. 1e）。SDダウンレギュレーション遺伝子の解析では、リンパ球の分化と増殖、白血球の遊走、TNF-α、IL-1、IFN-γ産生などのサイトカイン産生などの免疫系パスウェイの抑制が見られた（図1f）。KEGGパスウェイ解析では、SDのダウンレギュレーション遺伝子集団において、免疫関連用語が同様に濃縮されていることが示された（図1g）。興味深いことに、SARS-CoV-2スパイクタンパク質を切断し、粒子の侵入を制御する58のFurinはSD後に発現が増加した。一方、自然免疫応答を開始するいくつかのToll様受容体（TLR）は、COVID-19病原性を制御すると示されている59, 60のTlr3、Tlr7、Tlr9を含むすべての遺伝子が減少した（図1h）。また、炎症性転写因子NF-κBの主要な負の制御因子であるNfkbiaとその抑制因子Tle1のレベルは、SD後にそれぞれ46％と43％増加した。さらに、GO BP解析により、NF-κBの負の制御に関与する12個のSDアップレギュレーション遺伝子と、NF-κBの正の制御因子をコードする23個のSDダウンレギュレーション遺伝子が、NF-κB機能の増大という純影響を受けていることが判明した。SDダウンレギュレーション遺伝子のうち、合計215の有意なGO BPタームが濃縮され（調整済みp値<0.01）、そのうち154（72%）は免疫系パスウェイを構成していた。このうち、自然免疫に特異的な用語は18%、適応免疫に特異的な用語は23%であった（図1i）。これらの結果から、肺では、急性SDが自然免疫系と適応免疫系の両方を抑制し、ウイルス宿主細胞の侵入、細胞内複製、トラフィッキングに重要な複数の経路に影響を及ぼすことが示唆された。

補足図1
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補足図1
独立した睡眠不足の肺サンプルのqRT-PCR解析は、私たちのRNAシーケンスデータの頑健性を実証している。
a RNA-SeqとqRT-PCRで検出された各遺伝子のLog2倍変化を直接比較。 b RNA-SeqとqRT-PCR遺伝子発現データ間のピアソン相関分析により、これらが有意に正の相関があることが示された。コントロールとSD肺サンプルにおけるc 2310039L15Rik、d Angplt4、e A3galt2、f Tsc22d3、g Klf15、h Maff、i Hyou1、j Trim59、k Treml4、l Blnk、m Dbp、n Clec2iおよびo Ifitm6についての相対発現を示す。bのデータは平均値、aおよびc-oのデータは平均値±SEMである。統計解析は、対応のない片側Student's t-testで行った。ns P > 0.05, * P < 0.05, ** P < 0.01.

図1
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図1.
急性睡眠不足は肺のトランスクリプトームを大きく変化させ、免疫系を弱め、ウイルス感染性に関与する経路をアップレギュレートする。
a ZT0 - ZT6の間、WT動物に自由行動下での睡眠（Control）または睡眠不足（SD）を許可した。b 同定された18,325の転写産物のうち、4,523がSD後に差分発現し、2,366がアップレギュレーション（SD-Up）、2,157がダウンレギュレーション（SD-Down）した。d GO Biological Process (BP) のエンリッチメント解析とタームネットワークの可視化、e SD アップレギュレーション遺伝子の KEGG パスウェイエンリッチメント解析 f GO BP のエンリッチメント解析とタームネットワークの可視化、g SD ダウンレギュレーション遺伝子の KEGG パスウェイエンリッチメント解析。h SD差分遺伝子のVolcanoプロット。SD-Up（赤）およびSD-Down（青）遺伝子をハイライト。 i SDダウンレギュレーションGO BPタームの分類では、72%が免疫関連であり、このうち23%が適応免疫、18%が自然免疫、31%が一般免疫に関するタームであることが判明した。cのデータは行ごとにZ-scoreで正規化。RNAシーケンスデータの統計解析はDESeq2を用いて行い、調整p値＜0.05の遺伝子を有意とした。

急性睡眠不足は肺の概日リズムを乱す
急性SDは複数の末梢組織で概日リズム遺伝子発現を乱すことが以前報告されている44,47,48,61。そこで、肺の概日過程に対する睡眠剥奪の全容を検討した。マウス肺のリズミカルな遺伝子は、6時間間隔で区切られた1日4時点（ツァイトゲーバー時間（ZT）2、ZT8、ZT14、ZT20）の肺トランスクリプトームの配列決定により同定された。その結果、マウスの肺において24時間周期で有意に循環する遺伝子を2,029個同定しました（JTK q-value < 0.05）（図2a）。興味深いことに、これらの有意に循環する遺伝子のうち911個はSDによっても破壊され、肺のリズム遺伝子のほぼ50%がSD感受性であることが浮き彫りになった（図2b）。非リズミカルだがSD感受性のある3,532遺伝子のGO BP濃縮解析では、白血球の活性化や遊走などの免疫系関連用語が見つかった（図2c）。これは、これらの免疫遺伝子の多くが概日制御ではなく、SDに直接影響を受けていることを示している。しかし、注目すべきは、リズムとSDの両方が異なる遺伝子のGO BP解析で、遺伝子発現の概日制御が濃縮されていることが示され、SDが肺の概日制御ランドスケープを変化させることが明らかになったことである（図2d）。実際、代謝、シグナル伝達、RNA処理、タンパク質フォールディング、翻訳後タンパク質修飾を制御する経路もSD後にリズミカルに制御されなくなり（図2d）、正常な概日性肺生理学が広範囲にわたって破壊されていることが示唆された。

図2
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図2.
急性睡眠不足は肺の概日リズムの調節障害を引き起こす。
WT動物を12:12のLDサイクルに安定的に拘束し、その後、一定の暗闇の中に置いた。肺サンプルをCT2、CT8、CT14、CT20に採取し、RNAシーケンスを行った。 a 肺の2,029の有意に循環する遺伝子のヒートマップ。 b SD後に差次的に発現する遺伝子と肺循環系遺伝子の比較により、SDによっても破壊された991のリズム遺伝子を発見した。c マウス肺で非周期的であるが SD により破壊された 3,532 の遺伝子（緑）、および d マウス肺で周期的であるが SD により破壊された 991 の遺伝子（青）の有意に濃縮された GO BP 項のネットワーク視覚化。各ノードはGO BPタームを表す。e コントロールとSD肺サンプルにおけるコア概日時計遺伝子のRNAシーケンス数。 f 概日（CT）サンプルのPCA投影で、10個の既知の概日転写物から決定したPC空間における概日（CT）。黒いスプラインは一定条件下でのマウス肺の概日運動の推定値を表し、グラフはCTサンプル間の分離ができるだけ明確になるような向きで描かれている。g 線形カーネルを用いたサポートベクターマシン（SVM）アプローチにより、3次元主成分空間においてコントロールサンプルとSDサンプルを最適に分離する平面を求めた。この平面の法線上にサンプルを投影したところ、2群間で明確な分離が見られ、統計的に有意であった（Wilcoxon rank sum test - p = 0.0022）。したがって、SDは肺のトランスクリプトームの概日リズムを乱す結果となった。aのデータは行ごとに正規化したZ-score、eのデータは平均±SEM。サイクリング遺伝子はMetaCycleを用いて決定し、補正q値<0.05の遺伝子を有意にリズムがあるとみなした。fとgについては、Wilcoxon rank sum testを用いて統計解析を行った。

そこで、急性SDによる肺の概日リズムの乱れの程度を定量的に調べることにした。Bmal1 (Arntl1)、Clock、Per1、Cry2、Roraなどである（図2e）。このことは、この時点（ZT6、SD後）では、中核的な分子概日時計の完全性と時計制御の遺伝子発現が低下していると思われることを示唆している。肺のトランスクリプトームの主成分分析により、肺の概日リズム機能不全を評価することができた。ZTトランスクリプトームデータセットから得られた10個の概日リズム転写産物群の主成分方向（図2a）を用いて、すべての肺サンプルを3次元空間に投影し、肺に期待される概日リズムの時間と挙動を表すスプラインを当てはめました（図2f）。このスプラインからの逸脱は、概日リズムの異常を表すことになり、実際、このような結果が得られた。対照サンプル（黒い十字）が予想される位置でスプライン上に収まるのとは対照的に、SDサンプル（赤い十字）はずれており、SDが肺の概日リズムネットワークを破壊していることが示された（Fig.2f）。概日リズムトランスクリプトームへの影響を定量化するために、サポートベクターマシン法を用いて、コントロールサンプルとSDサンプルを最大に分離する平面を探した。図2gに見られるように、最適な平面では、SD群とコントロール群の間に明確かつ有意な分離が認められました（Wilcoxon rank sum test p = 0.0022；図2g）。これらのデータは、急性SDが肺の概日リズムを変化させることを示しており、この乱れが呼吸器系ウイルス感染に対する感受性を高めることに寄与していると考えられる。

SARS-CoV-2感染に関与する宿主因子は、睡眠遮断後のマウスの肺で異なる発現を示す
我々のデータは、急性SDが呼吸器系ウイルスによる感染を促進するために、2つの重要な方法で肺の転写風景を変更することを示している。第1に、自然および適応免疫応答を抑制することによって、第2に、肺の通常の概日制御風景と生理を破壊することによってである。Daniloskiら55、Zhuら57、Weiら56による3つの独立した研究では、SARS-CoV-2感染を制御する遺伝子を特定するためにゲノム規模のCRISPR機能喪失スクリーニングが実施された。そこで、これらのデータを用いて、SDがSARS-CoV-2が必要とする宿主因子の発現を変化させるかどうかを検討した。Daniloskiらは、SARS-CoV-2の複製に関連する可能性のある1,200の遺伝子を同定し、最も濃縮された50の55を調査した。この50個のうち、10個がSD後に制御されなくなり（図3aおよびd）、そのうち8個がSARS-CoV-2の複製に推定される機能を持つことがわかった（図3g）。例えば、ウイルス侵入に必要なSARS-CoV-2スパイクタンパク質の活性化に関与する液胞ATPaseプロトンポンプのメンバー（ATP6V0B、ATP6AP1、ATP6V0D1）、エンドソーム輸送経路で機能するARP2/3複合体の一部、ACTR2およびACTR3などである。Zhuらは、ウイルス侵入に関与する可能性のある32の遺伝子を同定した57。そのうち、SD差のある遺伝子は8つあり（図3bとd）、それぞれ4つがアップレギュレーション（NPC1、NPC2、CCDC93、WDR81）、ダウンレギュレーション（COMMD8、COMMD10、ACTR2、ACTR3）であることが判明した。8つの遺伝子はすべて、エンドソームへの侵入、エンドリソームへの融合、エンドソームの再利用に関与している（図3g）。Weiら56によって同定された最も濃縮された50の宿主因子とSD差分遺伝子を相互参照すると、11の遺伝子が交差することがわかった（図3c）。そのうちの8つは、主に転写制御に関連して発現が増加している（DPF2、JMJD6、RAD54L2、CREBBP、RYBP、ELOA、KMT2D、SIK1 - 図3g）。3つの研究すべてにおいて、これらの推定SARS-CoV-2宿主因子をコードする個々の転写物に対するSDの効果を図3dに示す。したがって、急性SDは、多くの宿主因子とSARS-CoV-2のライフサイクルの複数のステップに影響を与えるプロセスを明らかに増幅する。

図3
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図3.
SARS-CoV-2と相互作用し、感染に必要な重要な宿主因子が、睡眠不足後のマウスの肺で異なって発現している。
a-c a Daniloskiら（2021）、b Zhuら（2021）、c Weiら（2021）が決定したマウス肺の全SD差分遺伝子とウイルス感染の重要宿主因子の重なりのベン図。 d 重なる重要宿主因子を強調（紫のダイヤモンド）しサブセットをラベルしたSD差分遺伝子のボルケーノ図。e Gordonら（2020b）が決定したマウス肺のSD差分遺伝子とSARS-CoV-2-ヒトタンパク質相互作用体の交点。 f SARS-CoV-2-ヒトタンパク質相互作用体と重なるSD差分遺伝子を強調表示（黄色のダイヤモンド）しサブセットを表示したVolcano plot。 g SD後にマウス肺で差分発現することがわかった重要宿主因子とSARS-CoV-2-ヒトタンパク質相互作用体の機能的な区分け。ボックスは、ウイルス感染性における機能的役割に従って色分けされている。SD差分遺伝子とSARS-CoV-2宿主因子および宿主インタラクトームとの重複の統計的有意性は、両側フィッシャーの正確検定で評価した。ERGIC = endoplasmic reticulum-Golgi apparatus intermediate compartment.小胞体-ゴルジ体中間コンパートメント。

次に、SD差分遺伝子が、SARS-CoV-2がコードするタンパク質と物理的に相互作用することが知られている宿主タンパク質をコードしているかどうかを探った。Gordonらは、29のSARS-CoV-2タンパク質54のうち26と相互作用するヒトの宿主因子を調査した。著者らは、信頼度の高い332のヒト-ウイルスタンパク質間相互作用を同定し、そのうち87は我々のSD-差分遺伝子と重複していた（Fig. 3e,f）。興味深いことに、重複する遺伝子のうち少なくとも40個は、RNA処理、ERタンパク質品質管理、細胞内輸送など、ウイルス複製に関与すると推定される機能を有していた（図3g）。さらに、重複する宿主因子のうち18個は、ミトコンドリアプロセス、ユビキチン化、免疫制御に関与しており、SARS-CoV-2の免疫回避に機能していると考えられる（図3g）。また、シグナル伝達経路の調節因子、凝固因子、エピジェネティック修飾因子は、SARS-CoV-2感染に影響を与えると思われる他の調節困難な相互作用因子の一部である。これらの結果から、SDは、SARS-CoV-2感染と相互作用し、ウイルス複製を促進する可能性のある、いくつかの宿主因子の発現の差を引き起こすことが明らかになった。

SARS-CoV-2のライフサイクル遺伝子に対する睡眠不足の影響
これらのデータを総合すると、急性のSDがSARS-CoV-2の生活環に重要な多くの宿主プロセスに影響を与えることが示唆される。そして、SD差異遺伝子がSARS-CoV-2の侵入、複製、輸送を促進するメカニズム経路を、上記のデータから総合的に提案する（図4）。細胞外膜貫通プロテアーゼSerine 4 (Tmprss4)、プロテアーゼFurin、ATP6v0b、ATP6AP1、ATP6v0d1 (vacuolar-ATPase proton pump members) は、スパイクタンパク質の活性化および切断に寄与し62、63、SD後に発現量が異なり、ウイルス侵入が促進されたと示唆された。細胞内のキャプシドが解かれた後、ウイルスRNAは二重膜小胞内で複製され、宿主のリボソームによって翻訳され、新しいウイルス粒子が組み立てられ、ゴルジ/ER経路を通過し、エキソサイトーシスによって放出される。SDでは、転写調節、エンドリソソーム融合、エンドソームリサイクルなど、これらの経路がすべて制御不能になっていた（図4）。

図4.
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図4.
SARS-CoV-2のライフサイクルにおける睡眠不足後の発現変動遺伝子の関与。
(1) SARS-CoV-2はACE2と結合し、TMPRSS2/4の有無によりエンドサイトーシスまたは膜融合で侵入する。 (2) ウイルスRNAゲノムは細胞質へ放出され、 (3-4) RdRpにより複製、 (5) 転写する。 (6) ウイルス構造タンパク質は宿主リボソームにより翻訳される。(7-8)ビリオンが集合し、(9)放出される。FURIN、TMPRSS4、GSK3A、SRPK1、CSNK1A1以外の示された差分発現遺伝子（SD-Upは赤文字、SD-Downは青文字）は、Gordonら（2020b）、Daniloskiら（2021）、Weiら（2021）、Zhuら（2021）の研究の少なくとも1つと重なる重要なホストファクターである。言及されたSD差またはウイルス遺伝子を標的とする薬剤は、緑色のフォントで表示されます。サイクリング遺伝子は黄色い時計で示す。ACE2 = angiotensin-converting enzyme 2、ERGIC = ER-Golgi apparatus intermediate compartment、RdRp = RNA-dependent RNA polymerase、TMPRSS2 = transmembrane protease serine 2. Du et al. (2009)およびBioRender.comによる「コロナウイルスの複製サイクル」から引用した。BioRender.comで作成された。

細胞内コレステロール輸送に関与する13の遺伝子（Tmem97、Syt7、Npc1、Npc2、Osbpl2、Serac1、Nus1、Vps4a、Anxa2、Lrp6、ATP6AP1、Pik3c3およびWdr81）はSD後に異なる発現が見られ、SDによるコレステロール代謝破壊を示すこれまでの知見と一致している64。SARS-CoV-2の宿主因子に関する4つの相互参照研究のうち3つ（図3）は、感染の危険因子としてコレステロールのホメオスタシスの破壊を特定しており、これは我々にとって興味深いものであった。細胞膜コレステロールは、SARS-CoV-2の融合と細胞侵入65に必要であり、この経路はほとんどのエンベロープウイルスに共通するものである。さらに、スタチンは回復時間を短縮し、COVID-19の罹患率および死亡率のリスクを減少させることが分かっている66,67。コレステロールがどのようにSARS-CoV-2の病原性に影響を与えるかは現在のところ不明であるが、脂質ラフトの破壊、膜生物物理学の修正、ウイルスの安定性と成熟の変化、および免疫機能障害がすべて潜在的メカニズムとして示唆されている 68-70.

最後に、SDは、SARS-CoV-2の複製の様々な側面を制御する翻訳後タンパク質修飾を変化させる。例えば、ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質は、SRPK1、GSK-3a、およびCSNK1によってリン酸化され71、3つのキナーゼをコードする遺伝子は、SD後の肺で異なって発現していることが明らかになった。スパイクエンベロープ糖タンパク質のパルミトイル化は、感染性に必要である。パルミトイル基転移酵素であるZDHHC5をノックダウンすると、スパイクタンパク質の脱パルミトイル化が起こり、膜融合とウイルス侵入が損なわれた72。そしてSDにより、肺でのZdhhc5転写物が増加した。これらの結果から、SDはSARS-CoV-2のライフサイクルに関わる多くの遺伝子の制御を異ならせることで、SARS-CoV-2の複製を促進する可能性が示唆された。

睡眠不足が抗SARS-CoV-2免疫反応およびウイルス免疫回避に及ぼす影響
ウイルスの複製への影響に加え、我々のデータは、SDが免疫関連遺伝子を抑制し、ウイルスの持続を可能にすることを示している。SD肺トランスクリプトームの解析では、免疫系のいくつかの構成要素の制御が変化していることが示された（図5）。インターフェロン産生の制御因子であるRNF41とTBKBP1は、SARS-CoV-2タンパク質54の標的となり、それらの遺伝子はSD後に差次的に発現することがわかった。さらに、SDは、NF-κBを誘導・抑制するE3ユビキチンリガーゼMib1およびTrim59を、NF-κB抑制因子Tle1とともに、それぞれ発現量の差を生じさせた73,74。これらのタンパク質は、SARS-CoV-2タンパク質と結合することが示されており、感染が免疫回避戦略としてNF-κB経路を妨害していることが示唆されている。SARS-CoV-2が宿主のユビキチン化機構を利用して自然免疫反応を回避していることを示唆する証拠が蓄積されている75,76。興味深いことに、ユビキチン化に機能的に関与するSD differential遺伝子6個（Mib1、Rnf41、Usp54、Cul2、Trim59、Usp13）はSARS-CoV-2のタンパク質と相互作用するタンパク質をコードしている54。重症のCOVID-19は、時に肺の合胞体（SARS-CoV-2感染細胞が融合してできた多核の単細胞）を伴い、免疫系を活性化させずにウイルスゲノムを移行させることができる77。最近、ANO6が合胞体形成を制御していることが明らかになった78。興味深いことに、我々はSD後にAno6の発現が上昇することを見出した。最後に、ミトコンドリア操作はコロナウイルスが宿主の免疫系を回避するもう一つのアプローチである79。そして注目すべきは、SARS-CoV-2タンパク質-タンパク質相互作用に関与することが知られている5つのSD差異ミトコンドリアホスト遺伝子（Dnajc19、ATP1b1、Dnajc11、Mrps25およびTimm29）が見つかったことである54。したがって、このことは、急性 SD が SARS-CoV-2 による免疫回避を特異的に促進する可能性があることを強調している。

図5.
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図5.
睡眠不足が抗SARS-CoV-2免疫反応とウイルスの免疫回避に及ぼす影響。
(1) ウイルスが宿主細胞に侵入する。ウイルスRNAは、（2）エンドソームのTLR、または（3）細胞質のRIG-IとMDA5によって検出され、MAVSが活性化される。(4) いずれの認識イベントもNF-κBとIRFを活性化し、 (5) 核内に移動して (6) IFNと炎症性サイトカインの発現を促進し、例えば、樹状細胞がウイルス抗原を採取して表示し、 (7) ナイーブCD8+T細胞を活性化するなどして抗ウイルス免疫プログラムを増幅させる。感染した宿主細胞内では、（A）ウイルス物質が分解され、MHCクラスI分子によって細胞表面に表示される。CD8+T細胞によって抗原が認識されると（B）、感染宿主細胞のアポトーシスが誘導される。SD-Upは赤文字、SD-Downは青文字で示されたすべての差分発現遺伝子は、SARS-CoV-2に対する急性自然免疫反応に関与していることがわかる。緑色の網掛けテキストボックス内の遺伝子は、Gordonら、(2020b)に記載されているように、ウイルス免疫回避に関与している。IFN＝インターフェロン、IRF＝インターフェロン制御因子、MAVS＝ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達タンパク質、MDA5＝メラノーマ分化関連タンパク質5、MHC I＝主要組織適合性複合分子クラスI、NF-κB＝核因子カッパB、RIG-I＝網膜酸誘導性遺伝子1。BioRender.comによる「Acute Immune Responses to Coronaviruses」からの引用です。BioRender.comで作成された。

結論として、本研究は、SDが、SCRDおよび交代勤務に伴う呼吸器系ウイルス感染症、ならびに重症COVID-19のリスク上昇を説明しうる形で、マウス肺のトランスクリプトームランドスケープを変化させることを示している。免疫反応の抑制、SARS-CoV-2の複製および免疫回避の促進は、SDによって調節される最も関連性の高い経路の一つである。さらに、睡眠不足に伴う肺の概日リズムの乱れが広範囲に認められ、これがSCRDの悪影響を促進および／または悪化させる可能性があることが示された。本研究で提案された仮説は、SD後にSARS-CoV-2をマウスに投与することで検証する必要がある。実際、これは重要な追跡研究であろう。しかしながら、これらの知見は、なぜSCRDが重度のCOVID-19と関連しているかを説明するのに既に役立ち、SARS-CoV-2の病原性の基礎となるメカニズムの理解に向けた将来の努力の指針となり得る。重要なことは、我々の観察結果は広範な呼吸器系ウイルスに適用可能であり、新たな治療法の開発への道筋を示す可能性があることである。

著者
LT、FVL、AA、HS、ET、AJが実験を実施した。LT、FVL、LU、MV、RDはデータを分析した。AJとSVは本研究を監督した。LT、FVL、JAM、AJは、全著者の意見を取り入れながら、原稿を共同で執筆し、編集を行った。

利害関係
他の著者は金銭的利害関係を宣言していない。

方法
動物
すべての研究は、8週齢以上の雄のC57BL/6マウスを用いて行われた。特に断りのない限り、動物は集団飼育され、12：12時間の明暗サイクル（白色LEDランプで100ルクス）のもと、餌と水を自由に摂取することができた。すべての動物実験は、英国内務省の規則（Guidance on the Operation of Animals (Scientific Procedures Act) 1986）およびオックスフォード大学の科学研究における動物使用に関する方針に基づき、3Rの原則に従って実施された。概日リズム解析のため、ツァイトゲーバー時間（ZT）2、ZT8、ZT14、ZT20に肺組織が採取された。睡眠剥奪（SD）実験では、動物をZT0からZT6の間の6時間、先に述べたように、探索行動を誘発する新規の物体を与えることで覚醒させた80。その後、動物を犠牲にし、肺組織を採取した。対照動物は、ZT0からZT6の間、自由に眠らせることができた。

RNA抽出およびRNA配列決定ライブラリー調製
TRIzolおよびRNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いて、肺組織試料から全RNAを抽出した。肺組織は700μlのTRIzol中で機械的に破砕し、140μlのクロロホルムを加え、試料を十分に混合した。RTで3分間インキュベーションした後、サンプルを15,000 xg、4℃で15分間遠心分離した。その後、透明な上層を注意深く集め、等量の70％エタノールと混合し、RNeasy Mini Kitを用い、製造者の指示に従ってオンカラムDNase消化を行い、RNAを抽出した。RNAを水で溶出し、TapeStationシステム（Agilent）を用いて、High Sensitivity RNA ScreenTapeアッセイでRNA濃度と品質を測定した。シークエンスライブラリーのmRNA精製とcDNA合成は、以下のインデックスキットを用いてIllumina Stranded mRNA Prepプロトコル（20040534）により実施した。IDT for Illumina RNA UD Indexes Set A, Ligation (20040553)を使用した。最終的なライブラリの品質と濃度は、製造元の指示に従ってStepOnePlusサーマルサイクラー（Applied Biosystems）でKAPA Library Quantification Kit（Roche Diagnostics）を使用して確認した。すべてのcDNAライブラリーは、Illumina NovaSeqプラットフォームでペアエンド戦略（読み取り長さ150bp）を使用して配列決定された。

qRT-PCR
mRNAは、QuantiFast SYBR Green PCR Kit（Qiagen）を用いて、StepOnePlusサーマルサイクラーで定量化された。サイクリング条件は、95 ℃ 5 分、95 ℃ 10 秒、60 ℃ 30 秒、72 ℃ 12 秒の 40 サイクル。各遺伝子のサイクル閾値は、2^-ΔCt 法に従い、ハウスキーピング遺伝子として ActB、Gapdh、Rn18s を用いて正規化した。

RNAシーケンスデータの処理
RNA-Seqデータの処理（品質管理、トリミング、ゲノムへのマッピング、リードカウント）は、Galaxy (v21.05) 81に組み込まれたツールを用いて行った。生シーケンスデータを含むfastqsangerファイルをusegalaxy.orgの公開Galaxyサーバーにアップロードした。シーケンシングデータの品質管理には、FastQC (v0.11.8) (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)を使用した。品質管理およびアダプターのトリミングには、Trim Galore! (v0.6.3) (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) を用いて、低品質塩基、ショートリード、Illuminaアダプターの除去を行いました。Nextera transposaseをトリミングするアダプター配列として指定し、Trim Galore!はリード1およびリード2の5'末端から1 bpを除去するよう指示しました。FastQCを再実行し、品質の向上を評価しました。HISAT2 (v2.1.0) 82 を用いて、鎖情報を reverse に指定し、Mus musculus (mm10) reference genome にマップした後、 featureCounts (v2.0.1) 83 を実行して各遺伝子にマップされたリード数を定量しました。featureCounts 組み込みの mm10 遺伝子アノテーションファイルを選択し、paired-end reads options で、reads の代わりに fragments をカウントするオプションを有効にした。FastQC、HISAT2、featureCountsの結果を集約するために、MultiQC (v1.9) 84を使用しました。

遺伝子発現の差分解析
SDデータセットと時系列（ZT）データセットで差次的に発現している遺伝子（調整p値＜0.05）を特定するために、R（v4.1.0）のDESeq2パッケージ（v1.32.0）85を使用した。ヒートマップは、pheatmapパッケージ（v1.0.12）のpheatmap関数を使用して描画した。火山プロットは ggplot2 パッケージ (v.3.3.5) を用いて作成した。時系列（ZT）データの周期性を検出するために、MetaCycle Rパッケージ（v1.2.0）86を使用した。メタ2d関数は、shinyパッケージ（v1.6.0）をベースとしたMetaCycle Webアプリケーション（MetaCycleApp）を用いて実行した。minper = 24, maxper = 24, ARSdefaultPER = 24, cycMethod = JTK, combinePvalue = fisher のパラメータを指定した。補正後のq値<0.05を有意にリズミカルとした。MetaCycleAppは、https://github.com/gangwug/MetaCycleApp からダウンロードした。

機能的エンリッチメント解析
SD関連遺伝子とサイクリング遺伝子の機能的濃縮解析は、clusterProfiler Rパッケージ（v4.0.0）87を使用して実施した。GO BPおよびKEGG解析は、org.Mm.eg.db (v3.13.0) を Mus musculus genome annotationとして、enrichGO関数を用いて行った（GO BPパラメータ - pvalueCutoff = 0.01, qvalueCutoff = 0.05, pAdjustMethod = Benjamini-Hochberg correctionおよびKEGGパラメータ-pvalueCutoff = 0.05 ）。Enriched KEGG terms は、カスタム R スクリプトを使用して可視化した。また、過剰発現したGO BPパスウェイ間のネットワーク相互作用は、Cytoscapeソフトウェアのデスクトップ版（v3.8.2）90内のClueGOアプリケーション（v2.5.8）88とそのプラグインCluePedia（v1.5.8）89を用いて可視化した。デザイン指定には、yFiles Layout Algorithms アプリケーション (v1.1.1) の yFiles Organic Layout 91 を使用した。

概日性とSD転写産物発現の主成分分析投影
マウス肺の概日行動を評価するために、主成分分析（PCA）を使用した。まず、トランスクリプトームデータセットを10の概日特性、すなわち、マウス器官系全体で高度にリズムを持つことが知られている転写物（Arntl、Per2、Per3、Tef、Hlf、Dbp、Nr1d1、Nr1d2、Npas2、Dtx4）92に還元した。得られた転写産物×サンプル行列を対数変換し、列ごとにZ-score正規化し、次元削減のためのデータを準備した。特異値分解を時間ZT2、ZT8、ZT14、ZT20で収集した16サンプルに適用し、主な方向を得た（MATLAB v2020bのsvd関数を使用）。次に、すべての肺サンプル（時間経過およびSD）を、時間経過サンプルの最初の3つの主成分方向から生成された3D主成分空間に投影した。投影された時間経過サンプルの時間点平均は、ガウス分布のフィッティングにより推定された。投影された時間経過サンプルの推定された平均値を介して形状保存三次スプラインをフィットさせ、マウス肺の予想される概日行動を近似した（MATLABのcsape関数を使用）。次に、線形カーネルを用いたサポートベクターマシン法（R v.4.1.1 の gensvm v.0.1.5 パッケージ）を用いて、3次元主成分空間においてコントロールと SD 肺サンプルを最適に分離する面の方程式を求め、すべてのサンプルをその面の法線上に投影した。MATLAB（ranksum関数）を用いて、法線上への投影についてWilcoxonの順位和検定を行い、対照群とSD群が同一集団に属する（中央値が同じ）という帰無仮説が棄却されるかどうかを判断した。

統計解析
すべてのデータは平均値＋または±SEMで表し、nは各図の凡例に詳述されているように、群ごとの独立した動物または複製物の数を表す。2群間の比較には、片側不対数のStudentのt-testを使用した。遺伝子セットの重複の統計的有意性は、本研究におけるSDおよび時系列解析のRNA-Seqデータによって決定された肺トランスクリプトームにおける総遺伝子数21,647個と仮定して、両側フィッシャーの正確検定によって評価された。qRT-PCRとRNA-Seqの発現データ間の相関は、両側ピアソン相関分析を用いて検討した。統計解析は、R、MATLAB、GraphPad Prism 9（v9.1.2）を用いて実施した。

データの利用可能性
著者らは、本研究の知見を裏付けるすべてのデータは、論文およびその補足情報ファイル内で利用可能であるか、著者らの要請に応じて利用可能であることを宣言する。本研究で得られたRNA配列データは、GEO accession IDでNCBIに寄託される予定である。

謝辞
この研究は、以下の資金源から支援された。AJはBBSRCからBB/N01992X/1 David Phillipsフェローシップを受けた。LTはOxford-Elysium Healthのフェローシップの支援を受けている。JAMは、Wellcome Investigator Award 200838/Z/16/Z、UK Medical Research Council（MRC）プロジェクトグラントMR/R022011/1、中国医学科学院（CAMS）医学科学革新基金（CIFMS）、中国（助成番号: 2018-I2M-2-002 ）により資金援助を受けている。LUは、英国医学研究評議会博士課程訓練パートナーシップ（MR/N014294/1）の助成を受けた。MVは、Cancer Research UKからの助成金（RDへのC53720/A29468）の支援を受けている。

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このような場合、「研究者」、「研究者」、「研究者」、「研究者」、「研究者」、「研究者」、「研究者」、「研究者」、「研究者」、「研究者」、「研究者」、「研究者」、「研究者」、「研究者」、「研究者」、「研究者」、「研究者」、「研究者」、「研究者」、「研究者」の5つのカテゴリーに分類されます。このような場合、「このような場合、どのようにすればよいのか？
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2022年3月01日に掲載されました。
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COVID-19 SARS-CoV-2のプレプリント（medRxivおよびbioRxivより
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• bioRxiv の臨床研究パイロットプロジェクトが終了し、健康科学専用サーバー medRxiv（submit.medrxiv.org） が開設されたため、臨床試験および疫学の分野では新規投稿ができなくなりました。臨床試験の結果を報告する新規の論文は、medRxiv への投稿が必須となります。疫学分野の新規論文の多くも medRxiv に投稿されるべきですが、健康関連の情報を含まない論文であれば、著者は bioRxiv の他の分野（例：遺伝学、微生物学）に投稿することも可能です。

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